響應面法優化全豆豆腐凝固劑配方的研究

陳 杰 譚 琳 彭鈺淇 楊 俊 張 清 張黎驊

(四川農業大學食品學院1，雅安 625014) (四川農業大學機電學院2，雅安 625014)

全豆豆腐是以整粒大豆為原料，加工中無任何廢料產生的富含膳食纖維的營養型豆腐。利用干法工藝加工的全豆豆腐的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性均高于濕法工藝，且整體質構特性接近傳統工藝豆腐[1]。全豆豆腐加工工藝中熱變性蛋白凝聚是豆腐加工過程中決定豆腐質量和產量的關鍵過程，是豆腐加工過程中最難控制的工藝之一[2]；凝固劑的種類和添加量直接影響熱變性蛋白的聚集，從而影響豆腐的口感、風味、感官質量和出品率等[3-4]。

Li等[5]經研究發現使用鹽鹵(主要成分為MgCl2)制作出的豆腐風味極佳，但因鹵水凝固過程非?？?，難以控制，從而使豆腐的凝膠網絡結構不均勻、保水性差，而且豆腐里邊的蛋白質和大豆異黃酮等營養成分會隨著豆腐中水的流失而減少。Chang等[6]通過浸泡、打漿、過濾等工序，以TG酶為凝固劑，瓊脂為助凝劑生產豆腐，制得的豆腐硬度高、彈性好、蒸煮損失小。由此可見，單一凝固劑正逐漸被復配凝固劑取代。

吳超義等[7]以MgCl2凝固劑，TG酶為助凝劑，通過浸泡、漂燙、膠體磨磨漿和均質等工藝制備全豆鹽鹵充填豆腐，制得的豆腐成型完好，凝膠強度好，持水性較好。于濱等[8]以GDL為凝固劑，通過浸泡、磨漿、煮漿、膠體磨、超聲波和勻漿機處理等工藝制備全豆豆腐，探討了豆漿處理工藝對內酯豆腐質構特性的影響。Joo等[9]以超細全脂大豆粉為原料，以TG酶為凝固劑，通過兌水調漿、均質，煮漿等工序制備全豆豆腐，制得的豆腐硬度高、彈性好。Li等[10]通過浸泡、打漿、過濾、煮漿、冷卻、凝固等工序，以有機大豆為原料，以MgCl2為凝固劑，分別以卡拉膠、瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠為助凝劑生產有機豆腐，制得的豆腐口感好，與傳統豆腐相似。然而，在這些全豆豆腐加工研究中，由于全豆豆漿粒徑較大，內部的顆粒會阻礙豆腐的凝固，凝固效果并不理想；全豆豆腐凝膠成型不好，凝膠網絡結構不均勻，口感較粗糙等問題阻礙著全豆豆腐的生產發展，全豆豆腐凝固工藝尚不成熟，有必要對其進行深入研究。

本研究利用干法工藝制備全豆豆腐，單因素實驗觀察GDL、MgCl2、TG酶添加量對全豆豆腐硬度、膠著性、咀嚼度、凝膠強度等的影響。然后進一步以GDL、MgCl2、TG酶濃度為影響因素，以凝膠強度和感官評分為目標值進行響應面Box-Benhnken實驗，得出最佳凝固劑配方；同時對全豆豆腐的顯微結構進行觀察，并與傳統豆腐和單一凝固劑生產的豆腐進行對比，旨在為全豆豆腐產品的復配凝固劑開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆:貢秋豆8號，產于四川眉山;GDL、MgCl2、消泡劑：食品級；TG酶：酶活≥90 u/g，食品級。

YSC-701型超微粉碎機，S-4800型冷場發射掃描電鏡，DK-98-II型數顯恒溫水浴鍋，HK-20B型搖擺式高速中藥粉碎機，DHG-2200B型電熱恒溫鼓風干燥箱，TGL-16臺式高速冷凍離心機，ZEISS-EVO18型掃描電子顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆腐生產工藝流程

復配凝固劑全豆豆腐生產工藝流程：利用高速粉碎機將大豆進行粗粉碎，然后利用超微粉碎機對大豆粗粉進行超微粉碎。稱取100 g豆粉，以1:6的粉水質量比打漿(攪拌)，向生豆漿中加入0.03%(消泡劑質量:豆粉質量)的消泡劑，加熱至90 ℃保溫10 min；然后冰浴至室溫后加入復配凝固劑(GDL、MgCl2、TG酶)攪勻并分裝于100 mL燒杯中，50 ℃水浴保溫1 h，之后置于85 ℃水浴鍋保溫20 min。整個過程結束后，將豆腐放入冷水中靜置30 min，最后將豆腐放入4 ℃冰箱進一步熟化(貯藏)待測。

單一凝固劑全豆豆腐生產工藝流程：在冰浴至室溫的豆漿中加入單一凝固劑GDL，其余工藝與復配凝固劑全豆豆腐相同。

傳統豆腐生產工藝流程：將冰浴至室溫后的豆漿過濾，然后加入復配凝固劑(GDL、MgCl2、TG酶)，其余工藝與復配凝固劑全豆豆腐相同。

1.2.2 單因素實驗

分別考察GDL添加量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、0.9%)，MgCl2添加量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)，TG酶添加量(0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%)對全豆豆腐硬度、膠著性、咀嚼度、凝膠強度、保水率和感官評分的影響。每優化1個因素后所得到的優化水平應用于下一因素的優化中，各水平重復4次。其中，凝固劑添加量的百分比均為凝固劑與豆漿的質量比。

1.2.3 響應面優化實驗

根據單因素實驗結果，運用響應面Box-Benhnken設計理論[11]進行優化實驗，優化干法工藝制備全豆豆腐的凝固劑配方。實驗因素及水平如表1所示。

表1 響應面因素水平表

1.2.4 全豆豆腐質構分析及凝膠強度檢測

全豆豆腐的質構性質和凝膠強度采用質構儀進行測定[12]。采用TPA模式進行全豆豆腐質構分析，將豆腐置于質構儀載物臺上進行測試。測定參數為：探頭型號P/0.5，測前速率5.00 mm/s、測試速率1.00 mm/s、測后速率5.00 mm/s，間隔時間5 s，壓縮形變率30%，記錄全豆豆腐的硬度、膠著性、咀嚼度和凝膠強度，每個樣品測定5次，取其平均值。全豆豆腐凝膠強度的測定在Return to Start模式下進行，測試距離為10 mm，除了無“壓縮形變率”和“間隔時間”以外，其余參數不變。

1.2.5 全豆豆腐保水率檢測

全豆豆腐保水率采用離心法進行測定[13]。測定時，取一小塊豆腐樣品，稱重記為m1，然后將其置于離心管中，在20 ℃、7 500 r/min條件下離心10 min，濾去離心析出的水分后，稱重記為m2，之后將豆腐樣品置于105 ℃烘箱中干燥6 h，再次對豆腐樣品進行稱重，記為m3，豆腐離心保水率測定按式(1)進行計算。

(1)

1.2.6 全豆豆腐顯微結構觀察

全豆豆腐的微觀結構采用掃描電鏡進行觀察分析[14]，樣品前處理如下。用雙面刀片把全豆豆腐切成約2 mm×2 mm×5 mm的薄片，用體積分數為2.5%，pH 7.2的戊二醛，于4 ℃條件下浸泡2.0 h進行固定，再用0.1 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10 min。然后用體積分數分別為50%、70%、80%、90%的乙醇進行脫水，每次10 min；再用無水乙醇脫水3次，每次10 min。之后用100%乙醇-叔丁醇(1:1，V/V)；純叔丁醇進行置換各1次，每次15 min。用真空冷凍干燥機對樣品進行干燥，待測。將冷凍干燥后的樣品用導電膠固定在樣品臺上，通過離子濺射在樣品上噴金后，將樣品轉移到SEM臺面上，在加速電壓10 kV的條件下，觀察全豆豆腐的形態結構并拍照。

1.2.7 感官評定

參考Pilgrim等[15]的方法并略作修改，選取經過感官培訓后的20名同學組成感官評定小組，分別從產品色澤、質地、組織形態和滋味這四方面，對產品進行評價，具體評分標準見表2。

表2 干法制備全豆豆腐的感官定量評定標準

1.3 數據處理

利用Microsoft Office Excel 2013軟件計算實驗數據均值和標準偏差；利用SPSS 17.0進行單因素試驗顯著性分析(P<0.05)；利用Design Expert軟件進行響應面實驗方差分析并建立二次回歸模型；利用Origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 GDL添加量對全豆豆腐品質的影響

不同GDL添加量對全豆豆腐質構性質、凝膠強度、保水率和感官品質的影響如圖1所示。

圖1 葡萄糖酸-δ-內酯(GDL)添加量對全豆豆腐品質的影響

由圖1可知，GDL添加量(0.2%～0.9%)可顯著提高全豆豆腐的硬度、膠著性、咀嚼度和凝膠強度(P<0.05)，而0.8%和0.9%之間，全豆豆腐的硬度和咀嚼度無顯著變化；0.6%和0.8%之間、0.8%和0.9%之間，全豆豆腐的膠著性無顯著變化；0.6%和0.8%之間，全豆豆腐凝膠強度也無顯著變化(P>0.05)。當GDL添加量增加至0.6%時，質構性質變化趨于平緩。隨著GDL濃度的增加，全豆豆腐的感官評分顯著降低(P<0.05)，但添加量在0.2%～0.5%時，全豆豆腐感官無顯著變化(P>0.05)。GDL添加量對全豆豆腐保水率呈先下降后上升，爾后趨于平緩的趨勢。GDL添加量從0.2%增加至0.4%時，全豆豆腐的保水率依次顯著降低(P<0.05)，而0.5%與0.4%之間、0.5%與0.3%之間無顯著差別(P>0.05)；當GDL添加量增加至0.6%時，全豆豆腐的保水率顯著上升，然后趨于平穩(P<0.05)，而0.6%、0.8%、0.9%、0.2%之間無顯著差別(P>0.05)。

王維堅等[16]研究發現，GDL用量增加會使豆腐的酸味上升。趙希榮等[17]指出，GDL添加量較少，豆腐易碎、易變形；GDL添加量過多，豆腐酸味過于嚴重。在類似的魚肉蛋白凝膠的形成過程中同樣如此，楊方等[18]報道，GDL的濃度越高，魚肉蛋白的pH值越低，越靠近魚肉蛋白的等電點，蛋白分子間的斥力越小，分子間的結合能力越強，凝膠強度越大，膠著性、咀嚼度和硬度越高，但GDL添加量過多會導致產品彈性下降及酸味明顯。當GDL為0.6%時，全豆豆腐酸味較明顯。因此，根據單因素實驗結果，綜合考慮全豆豆腐硬度、膠著性、咀嚼度、凝膠強度和感官評分，選取GDL添加量0.3%～0.5%作為響應面實驗的水平。

2.1.2 MgCl2添加量對全豆豆腐品質的影響

不同MgCl2添加量對全豆豆腐質構性質、凝膠強度、保水率和感官品質的影響如圖2所示。由圖2可知，MgCl2添加量對全豆豆腐的感官品質影響不顯著(P>0.05)，對全豆豆腐的硬度、膠著性、咀嚼度、凝膠強度和保水率有顯著影響(P<0.05)。MgCl2添加量在0.05%、0.1%、0.15%和0.2%之間，全豆豆腐的硬度、咀嚼度無顯著變化(P>0.05)，而當添加量增加至0.25%時，全豆豆腐的硬度和咀嚼度顯著降低。MgCl2添加量對全豆豆腐膠著性和凝膠強度的影響呈先上升后下降的趨勢，0.1%與0.15%之間、0.1%與0.2%之間、0.05%與0.2%MgCl2添加量之間，全豆豆腐的膠著性無顯著變化；而當MgCl2添加量增加至0.25%時，全豆豆腐的膠著性顯著降低；0.1%與0.15%之間、0.05%與0.2%之間，全豆豆腐的凝膠強度無顯著變化。

據報道，當MgCl2添加量較高時，可能會誘發凝膠細鏈交聯疏松結構的形成，從而減小了凝膠的硬度；而低濃度的MgCl2，可形成較致密、均勻的凝膠網絡結構[19]。宋蓮軍等[20]研究表明，當添加MgCl2的量過低時，造成豆漿中的蛋白質不能完全被凝固，從而導致豆腐三維網絡結構疏松；而MgCl2添加量過高時，會降低豆漿的pH值，使蛋白質溶解度降低，網狀結構的結合力減弱，從而降低豆腐的硬度、凝膠強度、膠著性、咀嚼度和保水性。

圖2 氯化鎂(MgCl2)添加量對全豆豆腐品質的影響

由圖2可知，全豆豆腐的保水率隨著MgCl2添加量的增加呈下降趨勢(P<0.05)，0.1%、0.15%、0.2%之間，0.2%與0.25%之間，全豆豆腐的保水率無顯著變化(P>0.05)。這與前人研究相符合。謝婷婷等[19]研究表明，Mg2+會破壞分子間(如蛋白質-蛋白質、蛋白質-水等)的相互作用力，MgCl2濃度越高，Mg2+破壞能力越強，網狀結構的結合力減弱，進而降低了凝膠的保水性。錢麗穎等[21]指出，MgCl2水溶液在豆漿中分散較快，蛋白質凝固迅速，MgCl2濃度越高，凝膠網絡形成速度越快，從而導致豆腐三維網絡結構不均勻，保水性降低。綜合考慮，選取MgCl2添加量范圍0.05%～0.15%作為響應面實驗水平。

2.1.3 TG酶添加量對全豆豆腐品質的影響

不同TG酶添加量對全豆豆腐質構性質、凝膠強度、保水率和感官品質的影響如圖3所示。

注：不同小寫字母或大寫字母之間表示差異顯著，P<0.05。圖3 TG酶濃度對全豆豆腐品質的影響

根據GB 2760—2014，豆類制品谷氨酰胺轉氨酶最大使用量為0.25 g/kg；因此，單因素實驗選取TG酶濃度范圍為0.005%～0.025%。由圖3可知，TG酶添加量對全豆豆腐膠著性、咀嚼度、保水率和感官品質的影響不顯著，而對全豆豆腐硬度和凝膠強度影響顯著。當TG酶添加量為0.025%時，全豆豆腐的硬度顯著提高(P<0.05)，隨著TG酶添加量增加，全豆豆腐凝膠強度呈緩慢上升趨勢；而0.005%、0.01%、0.015%、0.02%TG酶添加量之間豆腐的硬度和凝膠強度無顯著變化(P>0.05)，0.015%、0.02%，0.025%之間，全豆豆腐的凝膠強度無顯著變化(P>0.05)。這可能是因為過少的酶量對蛋白的水解程度不夠，不能催化大豆蛋白殘基形成ε-賴氨酸共價鍵，同時，在分子內或分子間不能產生共價交聯，從而導致全豆豆腐硬度和凝膠強度無顯著變化[22]；而當酶量足夠時，TG酶催化蛋白質側鏈中谷氨酰胺殘基γ-羥胺基團與賴氨酸的ε-氨基之間發生交聯反應，從而提高豆腐的硬度和凝膠強度[23]。綜合考慮，選取TG酶添加量0.015%、0.02%和0.025%作為響應面實驗水平。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計與結果分析

利用Design-expert Box-Benhnken實驗設計理論，以凝膠強度和感官評分作為響應值，選取GDL添加量、MgCl2添加量和TG酶添加量為影響因素，進行3因素3水平響應面優化實驗，見表3。

表3 實驗設計及其結果

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析

運用Design-expert 8.0.6.1軟件對表3數據進行多元回歸擬合，得到凝膠強度和感官評分對GDL、MgCl2、TG酶濃度的二次多項式回歸模型為：

(2)

(3)

對回歸模型式(2)和式(3)進行方差分析和回歸系數顯著性檢驗，結果見表4。感官評分模型P=0.074，表明回歸模型影響不顯著。凝膠強度模型P<0.000 1，表明回歸模型影響極顯著；失擬項P=0.781 2>0.05，表明失擬項不顯著，模型可靠。R2=0.983 4，調整R2=0.962 0，表明該模型能夠解釋98.34%的響應值的變化，擬合度高，實驗誤差小，可以用來對全豆豆腐的凝膠強度進行預測。

2.3 全豆豆腐復配凝固劑配方的確定及模型驗證

用Design-Expert 8.0.6.1軟件對回歸方程模型進行優化，得到全豆豆腐復配凝固劑最優配方為：GDL添加量0.5%，MgCl2添加量0.07%，TG酶添加量0.02%，此條件下全豆豆腐凝膠強度為184.254 g。

為驗證模型的可靠性，采用上述最優配方(GDL添加量0.5%，MgCl2添加量0.07%和TG酶添加量0.02%)進行3次實驗，3次實驗的凝膠強度的平均值為185.956 g，相對誤差為0.96%，和理論預測值基本吻合。因此，利用響應面法得到的全豆豆腐復配凝固劑最優配方真實可靠。

3 不同豆腐的質構和微觀結構分析

硬度、凝膠強度等質構參數是評價豆腐品質的重要指標之一，而豆腐的質構特性與其微觀蛋白網絡結構密切相關。不同豆腐掃描電鏡觀察結果如圖4所示。從圖4a可以看出，豆腐表面分布著大小不一的蛋白顆粒，沒有形成蜂窩網狀結構，孔洞較少，且分布不均。從圖4b可以看出，以GDL、MgCl2、TG酶作為復配凝固劑，用干法工藝制備的全豆豆腐，能形成高度致密、均勻、有序的凝膠網絡結構，而且孔洞的大小、形狀分布較均勻。從圖4c可以看出，以GDL為凝固劑，用干法工藝制備的全豆豆腐，能形成較好的三維網狀結構，但與加入GDL、MgCl2和TG酶的全豆豆腐相比，其凝膠結構松散、較粗糙，且孔洞較大。這與表5中豆腐的質構分析結果一致，即加入凝固劑GDL、MgCl2和TG酶的全豆豆腐的硬度、膠著性、咀嚼度和凝膠強度均高于加入單一凝固劑GDL的全豆豆腐，加入凝固劑GDL、MgCl2和TG酶的傳統豆腐的硬度、膠著性、咀嚼度和凝膠強度最低。

不同豆腐的質構分析結果如表5所示，不同豆腐之間的硬度、膠著性、咀嚼度、凝膠強度和感官評分有顯著差別(P<0.05)。

表4 回歸模型方差分析

注：*表示顯著；**表示極顯著。

圖4 豆腐顯微結構圖

表5 不同豆腐TPA分析結果

種類硬度/g膠著性咀嚼度凝膠強度感官評分傳統豆腐119.057±2.164c48.088±2.927b46.285±2.775b117.372±3.259c79.400±2.302b復配凝固劑全豆豆腐168.047±1.605a69.095±3.056a66.015±1.969a163.431±1.574a85.500±2.517a單一凝固劑全豆豆腐158.464±3.358b66.467±2.931a65.143±1.400a150.988±3.680b78.200±1.095b

注：同列數據右側的不同小寫字母間表示兩組數據間呈現差異顯著(P<0.05)。

凝膠的形成機制是蛋白質分子聚集并形成有蛋序白質網絡結構的過程，內酯豆腐生產過程中添加TG酶可明顯提高豆腐的彈性和凝膠強度，TG酶催化所形成的空間三維網狀結構使得凝膠性顯著提高[23-24]。熊曉輝等[25]研究表明，TG酶可以明顯改善豆腐的加工品質，與市售豆腐和對照樣品相比，添加TG酶的豆腐在煮沸后不分散，而且豆腐結構致密。這可能是由于TG酶的添加促進了大豆蛋白之間形成更多的交聯鍵，凝膠內部的結合力增大，從而使全都豆腐的硬度和凝膠強度顯著提高。據報道，MgCl2作為典型的二價鹽，可提高豆腐的凝膠強度和黏彈性[26]。余永名等[27]研究發現，鎂離子能促進蛋白重鏈之間的共價交聯，也可以和蛋白質側鏈—COOH形成鹽橋，從而對凝膠特性起到改善作用。

4 結論

4.1 建立全豆豆腐凝膠強度與GDL添加量、MgCl2添加量、TG酶添加量的二次多項式回歸模型，得到了全豆豆腐最優凝固劑配方。經實驗驗證，干法工藝制備全豆豆腐的凝固劑最優配方為：GDL添加量0.5%，MgCl2添加量0.07%，TG酶添加量0.02%，在此條件下生產的全豆豆腐的凝膠強度為185.956 g。

4.2 根據響應面Box-Benhnken設計理論進行全豆豆腐凝固劑配方優化實驗結果得出：GDL濃度對全豆豆腐凝膠強度的影響最大，MgCl2添加量次之，TG酶添加量最??；GDL添加量和MgCl2添加量的交互作用對凝膠強度影響極顯著。

4.3 利用復合凝固劑GDL、MgCl2和TG酶生產的全豆豆腐的硬度、膠著性、咀嚼度、凝膠強度和感官評分均高于傳統豆腐和單一凝固劑(GDL)生產的全豆豆腐，而且前者的微觀結構更加緊密均勻。

4.4 通過凝固劑復合的方式生產全豆豆腐，可以從根本上解決全豆豆腐成型困難的難題，利于全豆豆腐的工業化生產。

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