幽門螺桿菌通過NF-κB信號通路調控胃上皮細胞自噬及凋亡的機制研究

沈書旭

(營口市中心醫院醫務部，遼寧 營口 115001)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是導致慢性胃炎及胃潰瘍的主要因素，胃黏膜相關的淋巴組織癌變及胃癌的發生也與其息息相關，幽門螺桿菌已成為Ⅰ類致癌因子[1-2]。我國Hp感染率約為53%，且呈上升趨勢[3]，Hp感染已嚴重威脅著人類的健康，目前尚未發現有效的、徹底清除Hp的方法，而且關于Hp的致病機制目前還不明確，因此深入探究Hp感染機制，揭示致病機制，對于找到有效治療Hp感染的方法具有重要意義。

自噬是機體自我保護的免疫防御機制，參與調控機體的生長、分化、發育過程及多種疾病的發生過程，對抵抗病原體感染具有重要作用[4-5]。凋亡是受基因調控的細胞程序性死亡進程，研究發現，Hp感染陽性患者中胃黏膜細胞的凋亡率顯著高于感染陰性的患者[6]。細菌感染導致的自噬與凋亡可作為宿主細胞炎癥發生的觸發開關，但是關于Hp感染所致胃上皮細胞自噬與凋亡的機制還不清楚，本研究通過Hp體外感染人胃上皮細胞AGS，研究了Hp感染對AGS細胞自噬與凋亡的關系，并結合NF-κB特異性抑制劑SN50探討了可能的作用機制，以期為臨床預防和治療Hp感染提供參考依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器Hp菌株購自美國ATCC；人胃上皮細胞株AGS購自中國科學院上海細胞所；F12培養基、胰蛋白酶購自美國Hyclone；胎牛血清購自美國Gibico；萬古霉素(K0059)、多黏菌素(P1004)、吖啶橙(BNN2017)購自美國Sigma；Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3 ，LC3)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、p65、p-p65、β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Santa Cruz；Annexin V-FITC/PI 雙染凋亡檢測試劑盒購于Biouniquer Technology；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD；Sorcere Sorcere全自動菌落計數儀購自英國Sorcere；GDS7500紫外凝膠成像分析系統購自美國UVP。

1.2方法

1.2.1Hp菌株培養 自液氮罐中取出凍存的Hp菌種，迅速置于37 ℃水浴鍋中輕輕震蕩使其充分融化。3 000 r·min-1離心5 min后，吸取50 μL后棄去上清液，吹打混勻后劃線將Hp接種至腦心浸液血瓊脂平板，置于37 ℃，微需氧(10%二氧化碳、5%氧氣、85%氮氣)培養條件下培養48 h。挑取菌落至20 mL無菌Hp液體培養基中，置于三氣培養箱的搖床上，微需氧條件，37 ℃，100 r·min-1培養24～30 h。

1.2.2胃上皮細胞AGS培養 自液氮罐中取出凍存的AGS細胞，迅速放入37 ℃水浴鍋中輕輕震蕩使其充分融化，轉移至離心管中與F12培養基混勻后離心收集細胞沉淀，使用新鮮的細胞培養基重懸沉淀，取重懸液加入含10%胎牛血清的F12細胞培養液中，置于37 ℃，5%二氧化碳培養箱中培養。待細胞貼壁生長至皿底80%時，棄去舊培養液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后，0.25%的胰蛋白酶消化并收集細胞，細胞培養液重懸后按1∶4進行傳代培養。

1.2.3Hp感染AGS細胞方法 取對數生長期的AGS細胞，0.25%胰酶消化后離心收集細胞，細胞培養液重懸后顯微鏡下調整細胞濃度為2×105個/毫升，每孔2 mL接種于6孔板中，置于37 ℃，5%二氧化碳培養箱中培養。液體培養Hp 24 h，紫外分光光度計檢測細菌濃度(1A600=1×108CFU·mL-1)。待AGS細胞生長至皿底80%時，更換新鮮培養基，并按照細菌數：細胞數=100∶1加入Hp菌懸液，置于37 ℃，5% 二氧化碳條件下共培養0 h、3 h、6 h、9 h。

1.2.4流式細胞儀檢測AGS細胞自噬 分別向Hp時間梯度處理的AGS細胞、對照組AGS細胞、18 μmol·L-1SN50處理6 h的AGS細胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共處理6 h的AGS細胞中加入終濃度為1 mg·mL-1的吖啶橙溶液，37 ℃避光孵育15 min后，0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞，PBS清洗1～2次，向細胞中加入100 μL預冷的PBS溶液重懸沉淀，流式細胞儀檢測陽性熒光細胞率。

1.2.5流式細胞儀檢測AGS細胞凋亡 分別取Hp時間梯度處理的AGS細胞、對照組AGS細胞、18 μmol·L-1SN50處理6 h的AGS細胞、18 μmol·L-1SN50+Hp共處理6 h的AGS細胞，0.25%胰酶消化后顯微鏡下調整細胞濃度為2×106個/毫升，取1 mL細胞懸液離心并收集沉淀，PBS清洗2次后，加入500 μL結合緩沖液重懸細胞，加入10 μL磷脂結合蛋白Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6蛋白質印跡法檢測蛋白表達 取Hp時間梯度處理的AGS細胞，0.25%胰酶消化后收集細胞沉淀，加入細胞裂解液后冰上放置30 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min取上清液，BCA法檢測上清中的蛋白濃度。取50 μg蛋白按照體積比4∶1加入5×上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min制備蛋白樣品。蛋白上樣后豎直電泳，80 V電泳30 min后，換用120 V繼續電泳，直至溴酚藍跑出玻璃板。取出蛋白膠，冰浴條件下100 V轉膜，5%脫脂奶粉室溫孵育6 h，分別加入相應的一抗(1∶500)4 ℃震蕩培養過夜，TBST洗滌液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗滌液清洗后加入ECL發光劑進行顯影，利用自動凝膠成像系統采集圖像。

2 結果

2.1Hp感染對AGS細胞自噬的影響利用吖啶橙標記Hp刺激0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS細胞，流式細胞儀檢測陽性熒光細胞率分別為0 h(7.25±1.56)%、3 h(12.86±1.78)%、6 h(28.65±2.14)%、9 h(31.19±2.12)%，統計結果如圖1所示。4個時間段整體比較差異有統計學意義(F=112.723,P=0.000)，Hp刺激后AGS細胞自噬率隨著Hp作用時間的延長逐漸升高，Hp刺激3 h、6 h、9 h與0 h相比均差異有統計學意義(t1=3.587，P1=0.007；t2=13.683，P2=0.000；t3=15.307，P3=0.000)。

注：與0 h相比，aP<0.05

2.2Hp感染對AGS細胞凋亡的影響收集Hp刺激0、3、6、9 h的AGS細胞，流式細胞儀檢測各時間點AGS細胞凋亡率分別為0 h(9.25±1.56)%、3 h(14.86±1.78)%、6 h(29.65±2.14)%、9 h(33.19±2.12)%，結果如圖2所示。4個時間段整體比較差異有統計學意義(F=108.205，P=0.000)，Hp刺激后AGS細胞凋亡率隨著Hp作用時間的延長逐漸增加，Hp刺激3 h、6 h、9 h與0 h相比均差異有統計學意義(t1=3.587，P1=0.007；t2=13.044，P2=0.000；t3=15.307，P3=0.000)。

注：與0 h相比，at=4.53～8.22，P=0.001～0.004

2.3Hp感染對自噬及凋亡相關蛋白表達的影響

收集Hp處理0 h、3 h、6 h、9 h的AGS細胞，提取各組細胞總蛋白，蛋白質印跡法檢測各組細胞自噬及凋亡蛋白表達情況，結果如圖3所示。自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ及凋亡相關蛋白Bax的表達隨著Hp刺激時間的延長逐漸增高，其中Hp處理0 h、3 h、6 h、9 h時Beclin1的蛋白表達分別為(0.103±0.034)%、(0.276±0.046)%、(0.512±0.041)%、(0.579±0.036)%，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達分別為(0.179±0.084)%、(0.667±0.076)%、(2.987±0.120)%、(3.253±0.109)%,Bax蛋白表達分別為(0.127±0.014)%、(0.254±0.026)%、(0.413±0.021)%、(0.506±0.026)%，Bcl-2蛋白表達分別為0 h(0.453±0.023)%、3h(0.321±0.024)%、6 h(0.176±0.016)%、9 h(0.112±0.016)%。Hp處理3 h、6 h、9 h時Beclin1的蛋白表達、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達、Bax蛋白表達和Bcl-2蛋白表達分別整體比較均差異有統計學意義(F1=92.140，P1=0.000;F2=759.672,P2=0.000;F3=170.437，P3=0.000；F4=172.688，P4=0.000)。三者表達均顯著高于0 h時 Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bax的蛋白表達(tBeclin1 3 h=5.361，PBeclin1 3 h=0.001；tBeclin1 6 h=12.673，PBeclin1 6 h=0.000；tBeclin1 9 h=14.750，PBeclin1 9 h=0.000；tLC3Ⅱ3 h=6.044，PtLC3Ⅱ3 h=0.000；tLC3Ⅱ6 h=34.779，PtLC3Ⅱ6 h=0.000；tLC3Ⅱ9 h=38.073，PtLC3Ⅱ9 h=0.000；tBax3 h,=6.975，PBax3 h=0.000；tBax6 h=15.708，PBax6 h=0.000；tBax9 h=20.816，PBax9 h=0.000)，而凋亡相關蛋白Bcl-2蛋白表達隨著Hp作用時間的延長逐漸降低，在3 h、6 h、9 h蛋白表達顯著低于與0 h蛋白表達(tBcl-2 3 h=8.041，PBcl-2 3 h=0.000；tBcl-2 6 h=16.873，PBcl-2 6 h=0.000；tBcl-2 9 h=20.772，PBcl-2 9 h=0.000)。

注：與0 h相比，aP<0.05

2.4Hp感染對NF-κB通路蛋白表達的影響Hp作用于AGS細胞0 h、3 h、6 h、9 h后，收集各組細胞提取各組總蛋白，蛋白質印跡法檢測各個時間點p65、p-p65蛋白表達變化，并進行統計，0 h、3 h、6 h、9 h四個時間段內p65和p-p65的蛋白表達分別為(0.678±0.030)%、(0.673±0.034)%、(0.664±0.037)%、(0.681±0.041)%，(0.100±0.011)%、(0.211±0.015)%、(0.387±0.026)%、(0.415±0.031)%，結果如圖4所示。p65蛋白表達在0 h、3 h、6 h、9 h間差異無統計學意義(F=0.130,P=0.940)，p-p65蛋白表達在0 h、3 h、6 h、9 h蛋白表達具有明顯變化，整體比較差異有統計學意義(F=134.791，P=0.000)，其中Hp作用3 h時即開始顯著增高(t=6.109，P=0.000)，其表達隨著Hp作用時間的延長明顯增強。

注：與0 h相比，aP<0.05

2.5Hp感染聯合NF-κB抑制劑對AGS細胞自噬及凋亡的影響為了檢測Hp感染是否通過NF-κB信號通路促進AGS細胞自噬與凋亡，利用NF-κB通路抑制劑SN50與Hp共處理AGS細胞6 h，并檢測各組細胞的自噬及凋亡情況，結果如圖5所示。對照組、Hp、SN50處理后以及Hp與SN50聯合處理后AGS細胞自噬與凋亡率分別為(11.76±1.70)%，(13.25±1.56)%，(28.65±2.14)%，(29.65±2.14)%，(6.56±1.40)%，(9.86±1.78)%，(19.65±2.14)%，(20.65±2.14)%，4組AGS細胞自噬與凋亡率分別整體比較差異有統計學意義(F1=79.582，P1=0.000，F2=67.421,P2=0.000)。與對照組AGS細胞自噬與凋亡相比，Hp處理AGS細胞自噬與凋亡顯著增強(t1=11.054，P1=0.000;t2=10.456，P2=0.000)；SN50處理后，AGS細胞自噬與凋亡顯著減弱(t1=3.403,P1=0.009;t2=2.799,P2=0.023)；Hp與SN50聯合處理后，AGS細胞自噬與凋亡顯著高于對照組，但低于Hp單獨處理組，差異有統計學意義(t1=5.164,P1=0.001;t2=5.890,P2=0.000;t3=4.718,P3=0.002;t4=5.738，P4=0.000)。

注：與對照組相比，at=5.46～8.34，P =0.001～0.003；與Hp組相比，bt=4.23～8.56，P=0.001～0.004

3 討論

自噬是在真核細胞中普遍存在的一種現象，依賴于溶酶體的自我消化及再循環機制，進化過程中高度保守[7]。自噬的發生起始于自噬體的形成，自噬體由細胞雙層膜包裹待降解物形成，自噬體形成后與溶酶體融合后被消化降解[8]。自噬能平衡細胞合成和代謝，起到穩定細胞內環境的作用，自噬還參與調控細胞的固有免疫及獲得性免疫應答過程[9-10]。

Hp感染胃上皮細胞后，細胞為了清除病原菌會誘發自噬的產生，以降解病原體及其所分泌的毒性物質，保護胃上皮細胞[11]。吖啶橙能進入溶酶體和自噬體中并能發生質子化，經吖啶橙標記的細胞無自噬溶酶體產生時呈現綠色，反之則呈現紅色，流式細胞儀用于定量檢測吖啶橙標記的陽性熒光細胞率，即為細胞的自噬率[12]。本研究通過吖啶橙標記Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h的胃上皮AGS細胞，流式細胞儀檢測自噬細胞率，結果顯示，Hp刺激3 h后，AGS細胞即出現自噬現象，細胞自噬率隨著Hp作用時間的延長逐漸升高，6 h時細胞自噬率達到高峰，隨后開始下降，說明細胞感染Hp早期即可快速啟動自噬的發生，以促進對病原菌的清除。Beclin 1蛋白參與形成自噬前體，引導與自噬相關的蛋白定位于自噬體膜上，從而促進自噬的進行，是調節自噬發生的重要因子，其表達在一定程度上反應了自噬的活性[13-14]。微管相關蛋白(microtubule associate protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)主要定位于前自噬泡及自噬泡膜的表面，參與形成自噬體，是自噬體特異性標記蛋白[15]，LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，自噬發生前，LC3蛋白主要以Ⅰ型狀態存在，自噬發生時Ⅰ型蛋白與自噬泡膜表面的PE結合形成Ⅱ型蛋白，結合到自噬體膜上[16]。本研究結果顯示噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ的表達逐漸隨著Hp刺激時間的延長逐漸增高，LC3Ⅰ蛋白表達隨著Hp作用時間的延長逐漸降低，Hp處理6 h對蛋白表達作用效果最顯著。說明Hp感染AGS細胞后促進了自噬的發生。

細胞凋亡是細胞受基因調控的主動性死亡過程，機體通過凋亡清除掉機體內衰老及畸形細胞[17]。Hp感染胃上皮細胞后，會誘使凋亡的產生以清除病變細胞。利用Annexin V-FITC/PI雙染色標記Hp感染0 h、3 h、6 h、9 h細胞，流式細胞儀檢測凋亡細胞，結果顯示，Hp感染3h細胞凋亡率出現顯著增加，6 h時凋亡率變化最顯著。Bcl-2家族是調節細胞凋亡的關鍵原件，其家族成員Bcl-2和Bax與細胞凋亡密切相關。Bcl-2蛋白可能通過阻斷細胞程序性死亡的一個早期環節阻遏細胞凋亡。Bax蛋白在細胞中通過與Bcl-2蛋白形成二聚體，使Bcl-2蛋白失活，從而調控細胞凋亡[18]。本研究結果顯示，Hp感染3 h后Bax的表達顯著增加，6 h時變化最顯著，Bcl-2蛋白表達則隨著Hp作用時間的延長逐漸降低。說明Hp感染AGS細胞后促進了凋亡的發生。

NF-κB信號通路廣泛參與機體的感染、免疫及凋亡進程，被認為在慢性炎癥轉變為癌癥的進程中具有重要作用[19]。在未受到刺激時，NF-κB二聚體p50/p65與其抑制蛋白IκBα形成多聚體，處于失活狀態，細胞受到病原菌感染等刺激時，IKK活化，使IκBα發生磷酸化，無活性的多聚體降解，暴露出NF-κB二聚體的核定位序列，二聚體進入核內，與靶蛋白結合，促進下游基因的表達[20]。檢測Hp感染對NF-κB信號通路蛋白的影響，發現Hp感染能顯著促進p-p65蛋白的表達，且隨著刺激時間的延長蛋白表達也隨之增強。說明Hp感染能影響NF-κB信號通路蛋白的表達，為了進一步驗證Hp感染是否通過NF-κB信號通路調控AGS細胞的自噬與凋亡，本研究利用NF-κB抑制劑SN50與Hp共同作用于AGS細胞，檢測AGS細胞的凋亡與自噬的發生；結果發現，與對照組相比，Hp處理AGS細胞自噬與凋亡顯著增強；SN50處理后，AGS細胞自噬與凋亡顯著減弱；Hp與SN50聯合處理后，AGS細胞自噬與凋亡顯著高于對照組，但低于Hp單獨處理組，說明Hp感染導致的AGS細胞自噬與凋亡的增強與NF-κB通路的活化有關。

綜上所述，Hp感染促進胃上皮細胞AGS的自噬與凋亡的發生，其作用機制與NF-κB通路的活化有關，上述結果可能為臨床開發新的預防與治療Hp感染的藥物提供理論依據。

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