育齡婦女葉酸代謝相關基因多態性分布研究

李曉娜,高秀葉,孫茗,趙雪杰,高航運,呂毅

(河南大學附屬鄭州頤和醫院檢驗醫學中心,河南 鄭州 450047)

研究證實孕婦機體葉酸水平不足是導致出生缺陷的主要原因，葉酸缺乏一般由補充不足和利用能力差兩方面因素引起；遺傳因素會影響葉酸的利用能力，如葉酸相關代謝基因功能異常，即便按正常量補充葉酸，也會造成機體葉酸水平不足。個體遺傳因素不同會導致機體對葉酸代謝能力的差異，利用基因檢測技術篩查出葉酸利用能力差的高風險人群，依據檢測結果合理補充葉酸，可大大降低神經管缺陷的發病風險，另外也可降低孕婦貧血、妊娠高血壓、早期流產、早產等的發生風險[1-5]。

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是葉酸代謝過程中的關鍵酶。MTHFR和MTRR基因存在多種基因多態性位點，MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點是最常見的突變位點。這些基因多態性會影響編碼酶的活性，導致血清中葉酸、維生素B12水平降低，同型半胱氨酸升高[2]。本研究旨在通過分析育齡期婦女MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G 位點多態性位點分布狀況，篩查出葉酸利用能力差的高風險人群，為其合理增補葉酸提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料依據患者知情同意及河南大學附屬鄭州頤和醫院醫學倫理委員會批準，選擇2015年8月至2016年8月在河南大學附屬鄭州頤和醫院婦科門診進行葉酸利用能力基因檢測的育齡婦女作為研究對象，納入標準為同意靜脈血采集的人群，排除非鄭州人群及DNA抽提不符合要求者，共計144例，年齡范圍19～42歲，年齡(27.1±5.2)歲。

1.2實驗方法

1.2.1DNA提取 采用乙二胺四乙酸鹽(Ethylenediaminetetraacetic acidm,EDTA)抗凝管抽取受試者3 mL靜脈血，用北京天根公司基因組DNA試劑盒提取DNA，TE(Tris-EDTA)緩沖液溶解，調節DNA濃度100 μg·μL-1。

1.2.2PCR擴增 MTHFR C677T的引物(北京六合華大基因科技有限公司)：正向引物FP：5-CCCCAAAGCAGAGGACTCTCTCTG-3；反向引物RP：5-CGAGGACGGTGCGGTGAGAGT-3；MTHFRA1298C的引物(華大科技)：正向引物FP：5-GCACGTCCCTCTGTCAGGAGTGTG-3;反向引物RP：5-TTGCCATGTCCACAGCATGGAG-3;MTRR A66G的引物(華大科技)：正向引物FP：5-CATGCCTTGAAGTGATGAGGAGGC-3；反向引物RP：5-ACTTGTTCTCACCCTGTG-3；反應體系含純水8.5 μL，Ex Taq酶12.5 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，DNA模板2 μL，總反應體系25 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個循環，72 ℃ 5 min后4 ℃保存。

1.2.3對PCR產物進行Sanger測序 將測序結果與標準序列比對(北京六合華大基因科技有限公司)。

2 結果

2.1Sanger測序結果分析PCR產物經Sanger測序后，通過峰圖比對可清晰的區分出該樣本攜帶的不同基因型：野生純合、雜合、突變純合。經過數據綜合，每個樣本在MTHFR基因 C677T、A1298C和MTRR 基因A66G位點的分析數據均被獲得。各種突變參見圖1～3。

圖1 部分樣品MTHFR基因C677T結果

圖2 部分樣品MTHFR基因A1298C結果

圖3 部分樣品MTRR基因A66G結果

2.2MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G基因多態性分布統計144例正常育齡婦女MTHFR基因 C677T、A1298C位點的基因型分布發現，MTHFR基因C677T位點在育齡婦女中的多態性，野生純合(CC)、雜合(CT)、純合突變(TT)基因型頻率分別為21.5%、40.3%、38.2%，C/T等位基因型頻率為42.0%、58.0%；MTHFR基因A1298C位點在育齡婦女中的多態性，野生純合(AA)、雜合(AC)、純合突變(CC)基因型的頻率分別為75.0%、22.2%、2.8%；A/C等位基因型頻率為86.0%、14.0%；進一步分析發現677CT與1298AC復合突變有23例；分析144例育齡婦女MTRR A66G位點基因多態性，AA、AG、GG基因型頻率分別為63.2%、31.3%、5.6%。A、G等位基因型頻率為78.0%、22.0%。

假設每個位點相對獨立，依據中國疾病預防控制中心葉酸利用能力的研究得出的結論，我們對MTHFR基因 C677T、A1298C、MTRR A66G三個位點進行綜合風險評定，根據檢測結果把個體葉酸利用能力的風險分為未發現風險、低度風險、中度風險和高度風險，指導個體實現個性化補充葉酸。

3 討論

基因的多態性在人類基因組中非常普遍，在某些情況下，基因多態性會導致蛋白質產物的生物活性發生改變。遺傳變異(多態性)在人類基因組中十分普遍，在某些情況下，可能導致蛋白質產物的生物活性改變。當MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點發生突變，可能導致血清中葉酸、維生素B12水平的降低，及同型半胱氨酸升高等一系列改變[6]。葉酸缺乏會影響母嬰健康，早期可能引起自然流產，孕中晚期引起孕婦胎盤早剝、巨幼細胞性貧血、妊娠期高血壓等的發生風險，我國婦幼保健中心建議備孕婦女孕前3個月開始服用增補400 μg葉酸，增補到孕3個月一般繼續增補，但隨著胎兒生長發育，母體的血容量、乳房、胎盤的發育使得葉酸的需要量大增，如孕婦同時伴有葉酸相關代謝基因的突變，更易造成葉酸不足[7-8]；孕婦體內葉酸含量不足胎兒則有發生神經管畸形、唐氏綜合征、唇腭裂、先心病的可能[1]。

本研究通過對育齡婦女進行MTHFR基因和MTRR基因多態性分析，發現MTHFR C677T位點CC、CT、TT基因型頻率分別為21.5%、40.3%、38.2%。TT型所占比例與已知的山東濰坊41.82%[9]接近，高于西安、廣西地區TT基因型頻率(分別為19.9%、15.7%)[10-11]；我們認為，采樣人群不同、研究地區不同都可能造成研究結果的差異。研究發現[12]，攜帶677TT純合子基因型時其體內MTHFR酶活性僅為45%，1298AC雜合子基因型其體內MTHFR酶活性為68%，而(677CT+1298AC)復合雜合子基因型個體MTHFR酶活性為41%。677CT和677TT變異基因型發生較高人群的血清葉酸濃度會顯著降低，同型半胱氨酸水平會升高，這些改變與巨幼細胞性貧血密切相關[13-16]。

綜上所述，通過葉酸代謝相關基因多態性檢測提示有部分育齡期婦女存在葉酸代謝障礙，加之妊娠3個月后不再增補葉酸，容易造成葉酸缺乏。對 MTHFR基因、MTRR基因相關位點的檢測，可直接評估個體的葉酸利用能力，實現個性化增補葉酸，使體內葉酸維持在適宜水平，為今后開展優生優育保健工作提供比較有價值的醫學遺傳學方面的參考依據。

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