UPLC-MS/MS同時測定大鼠血漿中美沙酮、文拉法辛及其代謝物濃度與藥動學研究Δ

李 好，陳連國，尤瑋瑋（溫州市人民醫院藥劑科，浙江溫州 325000）

鹽酸美沙酮（簡稱美沙酮）是一類μ阿片受體激動藥，具有鎮痛作用，被用于海洛因依賴脫毒和替代維持治療[1]。鹽酸美沙酮是目前發現的最為長效的阿片類鎮痛藥物，具有血藥濃度較穩定、成癮性小等優點，應用越來越廣泛。但是，美沙酮也存在個體差異較大、與其他藥物容易發生相互作用等缺點[2]。2-亞乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡咯烷（EDDP）是美沙酮的活性代謝產物，美沙酮在體內主要通過細胞色素P450（CYP450）中的CYP3A4和CYP2B6去甲基化，代謝生成EDDP。文拉法辛是抗抑郁藥物，屬于5-羥色胺和去甲腎上腺素的再攝取抑制劑（SNRI），是第二代非三環類抗抑郁藥物，其安全性及患者的耐受性明顯高于第一代抗抑郁藥，與第三代抗抑郁藥相當。O-去甲文拉法辛為其有效的活性代謝產物之一，也具有抗抑郁的作用。使用美沙酮維持治療的患者，或者是使用美沙酮鎮痛治療的患者，往往會與抗抑郁藥、抗人類免疫缺陷病毒藥物等聯用[3-4]，以降低患者在脫毒期間的抑郁、焦慮程度，但這些藥物之間往往又會發生藥物相互作用。

目前測定美沙酮和文拉法辛及其代謝產物的方法分別有高效液相色譜（HPLC）法、熒光吸收光譜法、紫外吸收光譜法等[5]，但均為單獨測定，尚未見采用液-質聯用法同時測定血漿中美沙酮和文拉法辛濃度的文獻報道。故筆者建立同時測定美沙酮和文拉法辛及其代謝產物濃度的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法，并將其用于美沙酮和文拉法辛及其代謝物的含量檢測及藥動學初步研究。

1 材料

1.1 儀器

XEVO TQD UPLC-MS/MS儀（美國Waters公司）；AE 200-S電子天平（浙江省科學器材進出口有限責任公司）；QL-901渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；Milli-Q Reference超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

鹽酸美沙酮對照品（美國Mallinckrodt公司，批號：P05077，純度：99.5%）；EDDP對照品（加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號：FN122109-01，純度：99.5%）；鹽酸文拉法辛對照品（美國Sigma-Aldrich公司，批號：98236-68-4，純度：98.0%）；O-去甲文拉法辛對照品（美國Sigma公司，批號：93398-62-8，純度：98.0%）；地西泮（內標，南京蘇耀建科技有限公司，批號：171225-200903，純度：99.0%）；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康成年SD大鼠8只，♂，體質量（257±23）g，由溫州醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產合格證號：SCXK（浙）2014-0001。大鼠飼養于清潔級條件下，動物房室溫維持在24℃左右，濕度約為60%～70%。于實驗前一晚8：00開始禁食，禁食12 h，不禁水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 美沙酮貯備液 精密稱取美沙酮對照品2.50mg，用甲醇溶解于10 mL量瓶中，得質量濃度為250μg/mL美沙酮貯備液。

2.1.2 EDDP貯備液 精密稱取EDDP對照品10.00mg，用甲醇溶解后轉移至25 mL量瓶中，甲醇定容，得質量濃度為400μg/mL EDDP貯備液。

2.1.3 文拉法辛貯備液 精密稱取文拉法辛對照品10.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，得質量濃度為400μg/mL文拉法辛貯備液。

2.1.4O-去甲文拉法辛貯備液 精密稱取O-去甲文拉法辛對照品5.00 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，得質量濃度為200μg/mLO-去甲文拉法辛貯備液。

2.1.5 地西泮內標溶液 精確吸取2.5 mg/mL地西泮標準溶液1 mL于25 mL量瓶中，甲醇定容，得質量濃度為100μg/mL地西泮甲醇溶液；精確吸取100μg/mL地西泮甲醇溶液1 mL于100 mL量瓶中，甲醇定容，得質量濃度為1μg/mL地西泮內標溶液。

2.2 色譜條件與質譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～0.5 min，35%A；0.5～1 min，35%～95%A；1～2 min，95%A；2～3 min，35%A）；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

2.2.2 質譜條件 采用電噴霧電離源（ESI），正離子模式檢測。去溶劑化氣體：氮氣；流速：1 000 L/h；溫度：500℃；離子源溫度：150℃；碰撞氣體：氬氣；流速：0.1mL/min；毛細管電壓：1 kV。用于定量分析的離子對為：m/z310.4→265.4（美沙酮）、m/z278.2→234.1（EDDP）、m/z278.1→57.8（文拉法辛）、m/z263.9→57.9（O-去甲文拉法辛）、m/z285.1→193.1（地西泮）。

2.3 血漿樣品處理方法

將保存于－80℃冰箱的血漿取出，置于室溫下解凍。渦旋混勻，取100μL血樣于1.5 mL離心管中，加入

地西泮甲醇溶液（1μg/mL）40μL和乙腈200μL沉淀蛋白，渦旋混勻2 min，以離心半徑為10 cm，13 000 r/min離心10 min，取上清液100μL于0.5 mL離心管中，加入100μL超純水稀釋，渦旋混勻，進樣測定。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取大鼠空白血漿（不加內標）、空白血漿加美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛，以及大鼠給藥30 min后的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析。結果，美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛和內標地西泮的出峰時間分別為1.66、1.58、1.37、1.19、1.79 min，且峰形良好，空白血漿對美沙酮及其代謝產物的檢測無明顯干擾，詳見圖1。美沙酮、文拉法辛及其代謝產物的質譜圖見圖2。雖然兩者出峰時間相近，但是在其相應的離子通道里，各物質無相互干擾。

2.4.2 線性范圍與定量下限考察 準確移取美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛標準貯備液200、125、100、200μL置于10 mL量瓶中，甲醇定容，得到美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛質量濃度為5μg/mL的混合工作液Ⅰ。將該混合工作液依次用甲醇稀釋，配成質量濃度為10、20、100、200、500、1 000、2 000、5 000ng/mL的美沙酮、EDDP混合工作液Ⅱ；質量濃度為8、16、80、160、400、800、1 600、4 000 ng/mL的文拉法辛、O-去甲文拉法辛混合工作液Ⅱ。準確移取各混合工作液Ⅱ各5μL，依次加入到8份100μL的大鼠空白血漿中，得到美沙酮、EDDP終質量濃度為0.5、1、5、10、25、50、100、250 ng/mL；文拉法辛、O-去甲文拉法辛終質量濃度為0.4、1.8、4、8、20、40、80、200 ng/mL的系列標準溶液，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄色譜圖。以血漿中待測物質量濃度為橫坐標（x），待測物與內標的峰面積比值為縱坐標（y）進行線性回歸，得美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛回歸方程分別為y＝0.006 5x+0.012 3（r＝0.999 7），y＝0.013 8x+0.039 9（r＝0.999 2），y＝0.013 4x+0.023 1（r＝0.999 9）；y＝0.01x+0.006 5（r＝0.999 9），美沙酮、EDDP的線性范圍為0.5～250 ng/mL，文拉法辛、O-去甲文拉法辛為0.4～200 ng/mL，定量下限（信噪比＞10）分別為0.5、0.5、0.4、0.4 ng/mL。

2.4.3 精密度、穩定性、重復性、準確度及基質效應考察 按相關要求進行操作。結果，美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛的日內（n＝6）、日間（n＝6）精密度的RSD均小于9.0%；方法回收率分別為94.20%～102.87%、90.93%～102.94%、92.95%～101.61%、90.33%～101.97%（RSD≤5.5%，n＝6）；提取回收率分別為85.90%～94.45%、85.97%～91.66%、87.97%～93.58%、88.53～94.54%（RSD≤5.9%，n＝6）；基質效應分別為95.96%～97.78%、92.33%～97.40%、95.28%～97.71%、95.33%～95.74%（RSD≤4.9%，n＝3）。穩定性試驗[室溫放置0、4、12 h，進樣器（4 ℃）中放置0、4、12 h，－80℃凍存1周、2周和4周和室溫下反復凍融3次]峰面積的RSD＜10.0%（n＝3）。均符合相關要求。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatogram

圖2 正離子模式掃描質譜圖Fig 2 Positive ion mode scanning mass spectra

2.7 藥動學研究

8只SD大鼠分別灌胃鹽酸美沙酮6 mg/kg、鹽酸文拉法辛10 mg/kg（溶劑均為超純水），每組4只，給藥劑量按臨床常用劑量換算。分別于給藥前及給藥后0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h經尾靜脈取血0.3 mL置于1.5 mL EP管中，以離心半徑為10cm，13 000 r/min離心10 min，取血漿，－80℃冷凍保存。

取大鼠血漿，按“2.3”項下方法處理后，按“2.2.1”項下條件進樣測定。得到美沙酮、EDDP、文拉法辛、O-去甲文拉法辛的藥-時曲線，詳見圖3。采用DAS 3.0藥動學軟件計算藥動學參數，結果見表1。

圖3 藥-時曲線圖Fig 3 Plasma concentration-time curves

表1 藥動學參數（±s，n＝4）Tab 1Pharmacokinetic parameters（±s，n＝4）

表1 藥動學參數（±s，n＝4）Tab 1Pharmacokinetic parameters（±s，n＝4）

藥動學參數AUC0-24 h，μg/（L·h）MRT0-24 h，h t1/2，h tmax，h CL/F，L/（h·kg）cmax，μg/L美沙酮201.95±51.14 3.55±0.21 1.42±1.02 1.12±0.43 31.93±15.15 52.21±5.42 EDDP 86.09±15.95 3.98±0.41 2.59±0.76 0.78±0.38 71.13±9.88 25.68±3.45文拉法辛75.38±23.95 1.44±0.21 0.63±0.08 0.60±0.22 142.10±46.42 52.64±2.29 O-去甲文拉法辛82.90±23.44 2.01±0.17 1.29±0.14 0.55±0.21 129.83±43.78 47.63±13.09

3 討論

美沙酮和抗抑郁藥有聯用指征[6]，美沙酮和文拉法辛聯合用藥可減少戒斷癥狀[7]。文拉法辛治療可能延長或者降低抑郁伴發阿片類物質依賴患者的復發時間或復發率，改善其抑郁癥狀[8]。文拉法辛能增強美沙酮的鎮痛作用，二者合用具有協同作用[9]。但二者協同的詳細機制尚待進一步研究，理論上二者可聯用于臨床復合麻醉和癌痛的鎮痛治療，并可減少成癮性鎮痛藥的用量，消除患者緊張焦慮情況，減少不良反應的發生，但其實際的臨床療效還有待進一步的觀察和驗證[9]。

美沙酮除為μ阿片受體激動藥外，也有一定的5-羥色胺再攝取抑制作用，故也有一定的抗抑郁作用[10]。文拉法辛是通過同時抑制5-羥色胺和去甲腎上腺素的再攝取而發揮作用。當美沙酮與5-羥色胺再攝取抑制藥聯用時，若不及時調整劑量，可能會導致5-羥色胺綜合征的發生。已有文獻報道，在合用美沙酮、環丙沙星和文拉法辛后，患者可發生5-羥色胺綜合征[11]。另有文獻報道，個別患者在聯用美沙酮、舍曲林和文拉法辛后，亦發生了5-羥色胺綜合征[10]。美沙酮的心臟毒性是其嚴重不良反應之一，包括QT間隙延長、尖端扭轉型心律失常等[12]。美沙酮的代謝主要與CYP3A4、CYP2B6等有關[13]。當這些藥物代謝酶的誘導劑或抑制劑與美沙酮聯用時，可使美沙酮的血藥濃度發生變化。特別是聯用抑制劑，可使美沙酮血藥濃度上升，可致QT間隙延長和尖端扭轉型心律失常的發生率增加。還有些藥物，本身所引發的不良反應也包括QT間隙延長，如胺碘酮、紅霉素、氟哌啶醇、特非那定、文拉法辛等[14]。當這些藥物與美沙酮聯用時，在QT間隙的延長發生率增加的同時，延長的時間也會增加，進而導致尖端扭轉型心律失常的發生。當美沙酮與其他藥物合用時，應注意是否有藥效上的協同作用，或者是否有藥動學上的相互作用發生，以免影響美沙酮的血藥濃度。

在前期試驗中，筆者先以乙腈-水為流動相，考察了二者多個體積比的分析效果，但峰形均拖尾嚴重。之后發現在流動相中加入0.1%的甲酸可以提高靈敏度和改善峰形[15]。由于文拉法辛為堿性物質，梯度洗脫中可在流動相的水相中加入酸，所以加入0.1%甲酸后，峰形得到改善，減少了拖尾現象，并且增加了檢測的靈敏度和精密度，提高了分離能力。因此本研究以乙腈和0.1%甲酸作為流動相。另，本試驗采用地西泮作為內標物。采用內標法可更進一步減少檢測干擾和系統誤差。血漿樣品處理是方法學建立的重要步驟，本研究采用乙腈沉淀血漿蛋白的方法處理樣品，方法簡單、用時較短，且萃取率高。

綜上所述，本研究建立的UPLC-MS/MS法可同時測定美沙酮與文拉法辛及其代謝產物的含量，且該法具有專屬性高、分離完全、檢測時間快的特點，可用于美沙酮與文拉法辛的血藥濃度檢測，以及為進一步研究美沙酮與文拉法辛及其代謝產物在大鼠體內的藥動學提供依據。

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