蔗糖、硼、鈣離子和γ-氨基丁酸對煙草花粉萌發的影響

周小利, 楊詩怡, 陳志蕓, 廖菊夠, 顧 菁, 呂立堂, 陳穗云

(1.云南大學 云南省高校植物病蟲害生物防控工程研究中心, 昆明 650091; 2.貴州大學 農業生物工程研究院山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025; 3.貴州大學 茶學院, 貴陽 550025)

花粉是高等開花植物的重要雄性生殖結構[1]，花粉的正常萌發和花粉管生長是保證精子細胞順利到達胚囊，并實現受精作用的前提，在植物生殖繁育過程中有極其重要的作用[2]?；ǚ酃艿目焖偕L使其穿入雌蕊組織輸送精子完成受精作用[3]?；ǚ酃苌L具有極性，在其進行極性生長時，不僅需要花粉粒中儲存的物質，還需從外界吸收糖分、硼酸和離子等物質，以提供花粉管正常生長和合成新的細胞壁結構。

糖類對植物花粉萌發及花粉管生長非常重要，蔗糖能為花粉的萌發提供能源物質，并且能夠維持花粉與培養液之間滲透平衡，防止花粉和花粉管的損壞和破裂[4]。大多數植物花粉離體萌發的蔗糖濃度在10%～20%之間[5]，如培養基中蔗糖濃度過低，提供花粉萌發的基礎營養不夠，花粉萌發就會受到抑制；但培養基中蔗糖濃度過高，則會造成花粉細胞原生質體脫水，抑制花粉萌發[6]。高質量分數蔗糖會抑制花粉萌發及花粉管生長，而蔗糖是光合作用主要產物，廣泛分布于植物體內，它是植物儲藏、積累和運輸糖分主要形式，用蔗糖來培養花粉比其他多糖效果更明顯，所以是最適合作為花粉萌發與花粉管生長的培養基[7]。硼酸在花粉管生長過程中也發揮了重要作用，據報道，細胞中98%的硼位于細胞壁，硼酸與果膠類物質RG2Ⅱ(鼠李半乳糖醛酸2Ⅱ)結合，使酸性果膠酯化[5]?；ǚ酃苌L過程中，酯化果膠和酸性果膠集中在花粉管的不同部位，其中酸性果膠在整個花粉管中積累，而酯化果膠主要集中在花粉管頂端，兩者共同作用增強細胞壁機械強度[8-9]，調節細胞壁的結構和性質，同時也阻止酚類物質的積累，更好地促進花粉管的生長[10]；另外，硼酸能夠使花粉對糖的吸收、轉運和代謝增加，進而形成糖硼復合體，增加氧的吸收[11]。一般情況下，花粉中貯存的硼含量不足，當花粉在柱頭上萌發時，柱頭會滲出硼離子補償花粉，滿足花粉萌發的最適硼離子濃度[12-13]。Ca2+是細胞內的調節信使[14]，具有調節胞內酶活性、促進細胞壁合成和調節細胞膨壓等多重作用；Ca2+能影響細胞骨架的組裝、分泌小泡的運輸和融合、花粉管生長方向等[15]。通?；ǚ酃艿捻敹松L要求細胞中游離鈣的動態平衡，如平衡被打破，花粉管生長受抑制。適宜的γ-氨基丁酸(GABA)對煙草花粉的萌發也起著重要的作用。適宜濃度的GABA促進花粉的萌發和花粉管的生長，高濃度的GABA抑制花粉管的萌發[16]。研究表明，GABA能結合到細胞膜上，可能通過GABA-B受體來調節花粉管Ca2+的通道，導致Ca2+內流并調節花粉管的極性生長[17]。非損傷測微技術證明了外源GABA會使花粉管Ca2+內流，從而使花粉管內Ca2+濃度增加[18]。因此，GABA和Ca2+在影響花粉萌發和花粉管生長過程中有相互促進和協調的作用。

煙草花粉萌發和花粉管生長對煙草雜交育種過程至關重要。目前，有關煙草花粉的研究主要集中在花粉活力的測定[19]、花粉形態學[20]和花粉超微結構[21]等方面。課題組前期開展了栽培煙草K326(N.tabacumL.cv.K326)同野生煙草種N.repanda、N.stocktonii(殘波煙草，斯托克通氏煙草，同屬于殘波煙草組)、N.alata(花煙草，碧冬煙亞屬)[22]種間雜交親和性及其生殖生理學基礎研究，表明N.tabacumL.cv.K32×N.alata表現為花柱雜交不親和障礙，而N.tabacumL.cv.K32×N.repanda、N.stocktonii則表現為柱頭雜交不親和[23-25]。本研究則主要對這幾個種花粉離體萌發的條件進行探索，確定了不同煙草種花粉離體萌發最適的蔗糖、硼酸、鈣離子和GABA濃度，以期豐富煙草花粉離體萌發影響因素的探究，并為研究上述煙草種間雜交親和性差異的原因提供指導。

1 材料和方法

1.1 材料的收集與處理

供試材料分別是花煙草(N.alata)、栽培煙草K326(N.tabacumL.cv.K326)、斯托克通氏(N.stocktonii)和殘波煙草(N.repanda)，于2015年10月播種于云南大學生物館東樓實驗基地，3—5月后，取始開期的花，用鑷子輕輕夾取雄蕊花藥放進1.5 mL eppendorf離心管中,室溫放置2 d，待其開裂后收集花粉。用一層濾紙包著大槍頭尾端，然后將濾紙包著的槍頭插進真空泵上的橡膠管中，打開抽真空按鈕，將槍口尖的一端放入收集了花粉的離心管中，吸附花粉，花粉被抽到槍頭中和濾紙上，將槍頭中和濾紙上的花粉收集在一個新的1.5 mL Eppendorf離心管中，而花粉粒殼不會穿過槍頭尖端，所以仍保留在原來的離心管中，通過這種方式吸附過濾后得到較純凈的花粉，干燥后于4℃下保存7 d待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 煙草花粉離體萌發培養基的設置

根據研究報道，本實驗研究設置了4種不同的蔗糖濃度：8%、10%、12%及16%，5種不同的H3BO3濃度：0.03、0.05、0.1、0.2及0.3 g/L，7種不同的CaCl2·2H2O濃度：0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08和0.1 g/L，4種GABA濃度：0.7、1、3和5 mmol/L。每組不同濃度的培養基重復3次。

首先，僅用4種蔗糖濃度(8%、10%、12%和16%)的單因素培養基離體培養煙草花粉，確定每個煙草種花粉萌發的最適培養基；在此基礎上，用最適蔗糖濃度+不同濃度的硼酸(0.03、0.05、0.1、0.2和0.3 g/L)確定每個種最適的蔗糖+硼酸培養基；之后，以最適的蔗糖+硼酸培養基加入不同濃度的Ca2+(0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08和0.1 g/L)，確定每個種最適的蔗糖+硼酸+Ca2+培養基，并以該培養基為基礎，尋找各個種最適的蔗糖+硼酸+Ca2++GABA培養基。

1.2.2 煙草花粉離體培養

用移液槍取200 μL的液體培養基于干凈的96孔板中，將保存在1.5 mL的離心管中的花粉加入蒸餾水混勻后，然后用移液槍分別向每個孔中加入40 μL的花粉混勻液，用槍吹打混勻。將96孔板用濕潤的濾紙遮蓋，放入28℃、黑暗環境的恒溫烘箱中培養3 h。

1.2.3 鏡檢

花粉在28℃黑暗恒溫烘箱中培養3 h后，用移液槍從96孔板吸取花粉培養液置于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，在Olympus BX51光學顯微鏡下觀察花粉萌發狀況并統計花粉萌發率[萌發率(%)=萌發的花粉數/花粉總數×100%]，用測微尺測量花粉管的長度(如花粉管長度≥花粉直徑為萌發，花粉管長度<花粉直徑為未萌發)。每個樣本統計150粒以上花粉，重復3次。

2 結果與分析

2.1 蔗糖濃度對煙草花粉萌發的影響

統計萌發3 h的煙草花粉萌發率，結果(圖1)顯示，蔗糖濃度在10%和12%時，花粉萌發率較高。N.alata和N.tabacumL.cv.K326花粉最適蔗糖濃度為10%，萌發率分別為46%和43% (圖1)，N.repanda和N.stocktonii在蔗糖濃度為12%時，花粉的萌發率分別達到最高值39%和36%。隨著蔗糖濃度逐漸升高，煙草花粉的萌發逐漸下降，在蔗糖濃度高于16%時，花粉萌發率低于25%。而在蔗糖濃度低于8%時，僅有N.alata花粉萌發率達到了25%，其他3個煙草種的花粉萌發率低于25%。

2.2 硼酸對煙草花粉萌發的影響

在最適蔗糖濃度的培養基中，加入不同濃度的硼酸，花粉的萌發率提高。由圖2可見，硼酸濃度達到0.05 g/L時，花粉萌發率最高，N.alata為72%，N.tabacumL.cv.K326為71%，N.stocktonii和N.repanda都為65%。硼酸濃度超過0.05 g/L 時，4個煙草種的花粉萌發率都呈現下降趨勢。

圖1 蔗糖濃度對煙草花粉萌發生長的影響Fig 1 The effect of sucrose concentration on tobacco pollen germination

圖2 硼酸濃度對煙草花粉萌發生長的影響Fig 2 The effect of boric acid concentration on tobacco pollen germination

2.3 鈣離子對煙草花粉萌發的影響

在最適的蔗糖硼酸培養基中添加不同濃度的Ca2+，結果表明在一定范圍內，隨著Ca2+濃度的增加，煙草花粉的萌發率上升。由圖3可見，當Ca2+濃度增加到0.05 g/L 時，花粉萌發率最高，N.alata和N.tabacumL.cv.K326萌發率分別為89%和90%，N.repanda和N.stocktonii花粉萌發率分別達到83%和86%。在最適0.05 g/L Ca2+濃度時，N.alata花粉萌發率比蔗糖硼酸培養基中萌發率增加20%，N.tabacumL.cv.K326和N.stocktonii增加19%，N.repanda增加21%。當Ca2+濃度≥0.1 g/L，N.repanda和N.Stocktonii、N.alata和N.tabacumL.cv.K326的花粉管生長受到明顯抑制。

2.4 GABA對煙草花粉萌發的影響

在最適濃度的蔗糖+硼酸+Ca2+培養基中，加入不同濃度GABA培養4個煙草種的花粉。從圖4可看出，培養基中加入0.7 mmol/L GABA后，供試的N.tabacumL.cv.K326、N.repanda和N.stocktonii花粉的萌發率分別為90%、83%和88%，GABA濃度達到1 mmol/L 時，3個種花粉萌發率分別為92%、 88%和89%(不加GABA時花粉萌發率分別為89%、83%和86%)。顯著性差異分析表明：3個煙草種在加入0.7 mmol/L GABA和1 mmol/L GABA時，與對照組CK3(10%蔗糖+0.05 g/L硼酸+0.05 g/L Ca2+，圖4)相比，花粉的萌發率差異不明顯；而當GABA濃度為3 mmol/L時，GABA對3個煙草種的花粉萌發率起抑制作用；值得注意的是，N.alata花粉加入不同濃度的GABA后，花粉萌發率降低，加入0.7 mmol/L GABA 時，花粉萌發率為81%，加入1 mmol/L GABA 時，花粉萌發率為84%。顯著性差異分析表明，這兩種GABA濃度下，N.alata花粉的萌發率差異不明顯，但均較對照組(圖5，CK3，萌發率為89%)萌發率降低，伴隨GABA濃度升高，其對花粉萌發率的抑制作用更明顯。

圖3 Ca2+對煙草花粉萌發的影響Fig 3 The effect of calcium concentration on tobacco pollen germinate

圖4 GABA對煙草種花粉萌發的影響Fig 4 The effect of GABA concentration on tobacco pollen germinate

根據上述研究，本實驗在不含Ca2+的培養基中檢測了GABA對N.alata花粉離體萌發的影響，結果(如圖6)表明：10%蔗糖+0.05 g/L 硼酸培養基中，濃度低于1 mmol/L 的GABA促進N.alata花粉離體萌發，最適GABA濃度為1 mmol/L，高于該濃度則抑制花粉萌發。在10%蔗糖+0.05 g/L 硼酸+0.05 g/L Ca2+培養基(圖3)和10%蔗糖+0.05 g/L硼酸+1 mmol/L GABA培養基(圖6)中，N.alata花粉萌發率分別為89%和91%，二者差異不顯著，表明最適濃度的Ca2+和GABA促進花粉萌發的作用相當。

圖5 GABA對煙草種N.alata花粉萌發的影響Fig 5 The effect of GABA concentration on N.alata pollen germinate

圖6 GABA對煙草種N.alata花粉萌發的影響(不含Ca2+)Fig 6 The effect of GABA concentration on N.alata pollen germination (without Ca2+)

3 討論

花粉離體萌發需要碳源(如蔗糖)、硼酸和礦物質(如鈣離子)。蔗糖為花粉萌發及花粉管壁的合成提供能源物質，而硼酸可以加強花粉離體萌發時對糖的吸收和代謝，鈣在花粉管頂端物質運輸和引導花粉管生長等過程中具有重要作用[26-31]。GABA則可能通過調控胞內鈣離子引導和調控花粉管生長[32]。已有研究表明，蔗糖對花粉萌發具有重要作用。添加適量的蔗糖對花粉的萌發有促進作用，但蔗糖濃度過高對花粉的萌發有抑制作用[33]。本實驗研究得出N.alata、N.tabacumL.cv.K326、N.repanda和N.stocktonii花粉離體萌發時，隨著蔗糖濃度的升高，花粉萌發率逐漸升高，但超過一定的量時花粉萌發受到抑制，而且N.alata和N.tabacumL.cv.K326花粉離體萌發比N.repanda和N.stocktonii需要的蔗糖濃度低，這可能是由不同煙草種之間內源糖含量差異引起，也可能是因為不同煙草種間花粉萌發的最適滲透壓不同。硼酸能夠增加花粉對糖的吸收、運轉和代謝，促進花粉萌發[34]。硼對花藥的花粉產生能力以及花粉粒生活力有重要的作用。硼能刺激花粉萌發和花粉管伸長[26]。4個煙草種離體萌發最適硼酸濃度都為0.05 g/L，超過該濃度則抑制花粉。最適蔗糖培養基中加入硼酸后，煙草花粉的萌發率有較大提高，這可能是由于硼離子與蔗糖容易形成絡合物，更有助于糖在植物組織中運輸，因此增加了蔗糖的吸收和代謝[35]。除此之外，硼還能參與果膠物質的合成，從而有利于花粉管壁的構造[13]，促進花粉萌發。

鈣是花粉萌發中非常重要的一個影響因子，Ca2+濃度過高將影響花粉管內細胞骨架的生理活動，會使花粉管頂端形成較厚的管壁，導致花粉管的生長受到抑制，適宜的Ca2+濃度能提高花粉的萌發率和促進花粉管的生長[26]。外源鈣能促進花粉的萌發，一定濃度的鈣還能使花粉管生長筆直，源鈣濃度過高會使花粉管生長出現細弱、畸形，而且容易斷落[36]。4個煙草種最適Ca2+濃度都為0.05 g/L，蔗糖+硼酸培養基中加入Ca2+極大促進了供試煙草種花粉離體萌發，表明煙草花粉離體萌發生長需要提供外源的Ca2+，這與花粉在柱頭上萌發生長需要雌蕊提供Ca2+一致，可能原因是煙草花粉內源Ca2+不能滿足花粉萌發生長所需。前人通過高效液相色譜(HPLC)測定GABA內源含量結果證明，煙草雌蕊組織中GABA從柱頭到子房呈梯度分布，濃度介于0.75～4.2 mmol/L 之間[17]，據此設計的外源GABA濃度為0.7～5 mmol/L。在最適的蔗糖+硼酸+Ca2+培養基中添加GABA表明，N.alata花粉萌發受抑制的GABA濃度較其他3個種低。由于前人報道指出，雌蕊來源的GABA可能通過促進花粉的鈣內流而調控其萌發和生長[17-18]，據此推測導致該結果的可能原因是，N.alata花粉內源鈣離子可能較其他3個種高，導致其對GABA的耐受性較低。另外，在無Ca2+的培養基中添加GABA培養N.alata花粉，最適濃度的GABA促進N.alata花粉萌發的效果和Ca2+無顯著差異，該結果表明，GABA也可能通過不依賴于促進外源鈣離子內流的途徑，在花粉萌發過程中發揮了作用。

4 小結

上述研究結果表明，外源提供的蔗糖、硼酸、Ca2+或GABA對于煙草花粉離體萌發具有重要作用，蔗糖、硼酸、GABA和Ca2+可能相互作用，共同促進花粉離體萌發。供試不同煙草種離體萌發所需最適外源物質濃度的差異，反映了煙草花粉的種間差異性，這種差異可能對煙草種間雜交親和性的差異有影響。后續將進一步探究不同煙草種內源Ca2+或GABA等物質含量差異，及其對種間雜交親和性差異的影響。

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