一株抗鎘真菌的鑒定及其抗性的初步研究

于洪飛，劉 森

(河南理工大學資源環境學院，焦作 454000)

煤炭作為主要能源，在相當長的時期內，在我國能源結構中的地位不會改變[1]。然而，煤中含有多種有害或潛在有害元素，在其采集、洗選、儲存、運輸過程中，會釋放到周邊環境中[2-3]。郭二果等[4]研究發現與采礦前比，土壤中As、Hg、Cu、Cd等重金屬含量均高于采礦前水平。馬從安等[5]對勝利露天煤礦重金屬含量調查，發現重金屬Cd的含量已經超標。煤礦區土壤中Cd和Pb對人體健康存在健康風險[6]，因此，礦區污染土壤的修復顯得尤為重要。在自然界中，微生物在重金屬的遷移、轉化過程中起著重要作用，可對土壤中的重金屬進行固定、移動或轉化，改變它們在土壤中的環境化學行為，可促進有毒、有害物質解毒或降低毒性，從而達到生物修復的目的[7]。

本文采用濃度梯度馴化的方法[8]，從校園內長期堆放煤的下層土壤中篩選出對鎘具有較強抗性的真菌，運用傳統形態學方法和18S rDNA序列分析對菌株進行了鑒定，同時研究菌株對Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Cr2+的重金屬抗性，為其實際應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 抗鎘菌株的篩選與培養

采用梯度濃度馴化法，從河南理工大學校園內煤場采集土樣，稱取3份土樣各10 g加入到90 mL的馬鈴薯葡萄糖(簡稱PDA)液體培養基(其中Cd2+濃度為100 mg/L)搖床培養3 d(28℃，150 r/min)，取培養液10 mL加入到PDA液體培養基(Cd2+濃度為200 mg/L)搖床培養3 d(28℃，150 r/min)，依此類推，鎘濃度逐漸遞增，最后Cd2+濃度達到2000 mg/L。取最后一批的培養液，將菌液涂布于鎘離子抗性平板(濃度為2000 mg/L的PDA固體培養基)，培養分離菌株。

1.2 形態與分子鑒定

1.2.1 形態鑒定

將1.1分離的菌株接種于PDA平板上，置于28℃下培養5 d，期間觀察菌落的顏色和形態。并在顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗及分生孢子的形態特征。根據《真菌鑒定手冊》[9]和《植物病原真菌學》[10]進行鑒定。

1.2.2分子鑒定

將菌株接種到PDA液體培養基中，搖床培養(28℃，150 r/min)3 d后抽濾得到新鮮的菌絲體。使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(No.B518229，上海生工生物工程有限公司)提取基因組。

采用NS1(5′-gTAgTCATATgCTTgTCTC-3′)和NS8(5′-TCCgCAggTTCACCTACggA-3′)兩個通用引物擴增18S rDNA序列[11]。PCR反應體系(25 μL)：基因組DNA 0.5 μL，引物 (25 μmol/L)各 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶0.25 μL，MgCl21.5 μL，ddH2O 16.25 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖電泳檢測，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(NO.B518131，上海生工生物工程有限公司)回收目的片段。

利用T4 DNA Ligase將其與pUCm-T 載體連接形成克隆質粒，再將重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，使用選擇性LB瓊脂平板篩選含重組質粒的白色克隆，提取質粒。通過上海生工生物工程有限公司測序，獲得的序列提交到NCBI數據庫，并應用BLAST 程序與數據庫中已有的基因序列進行同源性比對分析。應用MEGA6.0以N-J方法構建系統發育樹，對菌株進行系統發育分析。

1.3 菌株對其他重金屬的抗性檢測

用MIC(Minimal Inhibitory Concentration，最低抑菌濃度)來表示菌株對重金屬的抗性，MIC值越大，表示菌株對重金屬的抗性越大，反之，抗性越小。分別配制不同質量濃度的Pb2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+和Cr2+重金屬離子的抗性平板。用打孔器(直徑0.5 cm)從培養好的平板上打取菌落接種于抗性平板上，每個濃度3個重復，倒置培養(28℃)2 d后，開始觀察并記錄菌落直徑，以24 h內菌落直徑變化不顯著的視為不生長，被完全抑制。

2 結果與分析

2.1 鎘抗性菌株的篩選與形態鑒定

采用梯度濃度馴化方法篩選抗鎘菌株，當鎘離子富集濃度達到800～2000 mg/L之間時，發現培養基中只有一種真菌存在，培養液呈清澈透明狀，懸浮著大量表面粗糙的菌絲球，長勢良好，抗性平板培養后，得到一株抗鎘真菌，編號為M2。

菌株M2在PDA平板上初期菌絲為白色，疏松的絨毛狀，培養到72 h，菌落墨綠色絲絨狀，呈放射狀向外擴展，老熟后呈黑色，表面平伏，似氈狀(圖1)。分生孢子梗褐色，有隔，單生或簇生，直或彎曲(圖2-A)。分生孢子暗褐色，彎曲或呈新月形，大小(25～27.5)μm×(10～15)μm，具隔膜3個，大多4胞，中間兩個細胞膨大，其中從基部向上數第3個細胞特別大，顏色深；兩端細胞稍小，顏色淺(圖2-B)。

根據以上特征，菌株M2符合關于新月彎孢霉特征的描述報道[5-6]，初步鑒定為新月彎孢霉 (Curvularialunata)。

圖1 菌株M2在PDA平板上的菌落生長狀態Fig 1 The growth state of strain M2 on PDA plate culture medium

圖2 菌株M2的分生孢子梗及分生孢子(40×10)Fig 2 Sporangiophore and conidia of strain M2(40×10)

2.2 分子生物學鑒定

采用試劑盒提取到高純度基因組DNA，并成功擴增出18S rDNA基因(1731 bp)。通過同源性比對發現，M2(GenBank登錄號：KX852423)與Cochltobolussp.，Cochliobolusgeniculatus，Cochlioboluslunatus親緣關系接近，處在同一個大的分支。且與Cochlioboluslunatus(GenBank登錄號：JN941608.1)同源性達100%，序列覆蓋率100%。通過系統發育分析(圖3)，鑒定菌株M2屬于真菌界(Fungi)、雙核亞界(Dikarya)、子囊菌門(Ascomycota)、 子囊菌亞門(Pezizomycotina)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、格孢菌亞綱(Pleosporomycetidae)、格孢菌目(Pleosporales)、格孢菌科(Pleosporaceae)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)月狀旋孢腔菌(Cochlioboluslunatus)。

圖3 以18S rDNA基因序列為分子標記的系統進化樹Fig 3 The phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences

2.3 菌株M2對鎘離子的抗性檢測

菌株M2在鎘濃度500 mg/L到4000 mg/L的平板上均能生長，隨培養時間的延長，各個濃度下菌株M2的菌落直徑均緩慢增加，且隨鎘濃度的逐漸提高，菌株生長速度緩慢，菌落直徑增加的幅度變小(圖4)。鎘濃度在500～2000 mg/L時，菌落直徑在24 h內變化明顯，而高于2000 mg/L時，菌落直徑在24 h內增長幅度較小。當鎘濃度為4000 mg/L時，鎘抑制作用增強，菌落直徑增長不明顯?？梢?，鎘對菌株M2的最低抑菌濃度為4000 mg/L。同時還發現，在鎘抗性平板上的菌落中央菌絲體呈現灰色，邊緣乳白色，菌絲體緊密有褶皺，并分泌有褐色色素滲入培養基中，菌絲表面不易形成粉末狀孢子。

2.4 菌株M2對其他重金屬的抗性檢測

用MIC來表示菌株M2對鉛、銅、鋅、鎳、鈷和鉻的抗性。隨著重金屬濃度的增加，菌株M2對各個重金屬表現出不同的耐受性。低濃度的鉛對M2的抑制作用不明顯，當鉛質量濃度大于1000 mg/L時，抑制作用增強，鉛質量濃度達到1500 mg/L時，菌株生長被抑制，菌落直徑24 h內基本不變(圖5-A)，菌株M2對鉛具有很強的抗性。菌株對鋅、銅抗性也較強，當鋅和銅質量濃度分別達到600 mg/L和400 mg/L時，基本抑制了M2的生長(圖5-B、C)，鋅抗性平板上，菌落周圍亦產生褐色色素滲入培養基中。銅抗性平板上的菌落顏色偏深藍綠色。重金屬鎳、鈷、鉻對菌株的毒害作用較強，當鎳、鈷、鉻的質量濃度分別為100、80和60 mg/L時，M2的菌落直徑比接種時直徑(0.5 cm)只增加0.2～0.5 cm，可能是借助接種時帶入的培養基才有少量增長(圖5-D、E、F)。由圖5的抗性結果可知，鉛、鋅、銅、鎳、鈷和鉻對菌株M2的最低抑菌濃度分別為1500、600、400、100、80和60 mg/L。

圖4 不同質量濃度Cd2+對菌株M2菌落直徑的影響Fig 4 Influences of different mass concentrations of Cd2+ on the colony diameters of strain M2

圖5 不同質量濃度重金屬對菌株M2菌落直徑的影響Fig 5 Influences of different mass concentrations of heavy metal on the colony diameters of strain M2

3 討論

采用梯度濃度馴化的方法從校園內煤場土樣中分離得到抗鎘真菌M2，它在鎘濃度為2000 mg/L的液體培養基中生長良好，抗鎘性較強。根據形態學鑒定菌株M2為彎孢霉屬(CurvulariaBoedin)新月彎孢霉 (Curvularialunata)。通過18S rDNA序列分析鑒定菌株M2為旋孢腔菌屬(Cochliobolus)月狀旋孢腔菌(Cochlioboluslunatus)。彎孢霉屬的有性態是旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、擬旋孢腔菌屬(Pseudocochliobolus)[9-10,12]。月狀旋孢腔菌為旋孢腔菌屬的模式種[13]，新月彎孢霉即為月狀旋孢腔菌的無性態。因此，兩種鑒定方法結果一致。研究發現，菌株M2對多種重金屬有抗性，強弱順序為Cd2+> Pb2+> Zn2+> Cu2+> Ni2+> Co2+> Cr2+。

國內外報道的鎘抗性真菌種類主要有Metarhiziumanisopliae、Saccharomycescerevisiae、Fusariumoxysporum、Phomopsissp.[8]、Phanerochaetechrysosporium[14-15]、Paecilomyceslilacinus[16]、Gliocladiumviride、Mucorsp.和Aspergillusniger[17]。關于新月彎孢霉的研究，集中在產甾體化合物，產絮凝劑和產漆酶[18-19]等方面。新月彎孢霉對重金屬的抗性尤其是對鎘的抗性研究報道較少，馮宏等[20]從電子垃圾污染區土壤得到一株新月彎孢霉Cd7，其可在鎘質量濃度為2000 mg/L的PDA抗性平板上生長，菌株Cd7對9種重金屬離子抗性的強弱順序依次為：Zn2+、Cd2+(>2000 mg/L)>Pb2+(1500 mg/L)>Cu2+(500 m/L) >Co2+(100 m/L)> Ni2+、Cr2+(50 mg/L)>Hg2+、Ag+(25 mg/L)。M2和Cd7對鉛、銅、鈷、鎳和鉻的抗性差別不大，但對鎘和鋅的抗性上有較大區別。菌株M2可在鎘質量濃度為4000 mg/L的平板上生長，比Cd7的鎘抗性強。而Cd7可在鋅質量濃度為2000 mg/L的平板生長，比M2的鋅抗性強。這可能是由于兩個菌株分離來源不同，生存環境有差異，對重金屬的抗性有所不同。

從煤場區土壤中分離得到菌株M2，能夠在煤礦環境中生存，并對各種重金屬有一定的抗性。今后可進一步對其抗重金屬機制進行探討，為生物法修復煤礦重金屬污染提供有力的理論支持。

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