紅樹林沉積物中芘降解菌群及其代謝質粒轉化菌的研究

蔡麗希, 陳小萍, 劉黎星

(莆田學院 基礎醫學部，莆田 351110)

多環芳烴(PAHS)是一類廣泛存在于環境中的具有致畸、致癌、致誘變的典型有機污染物[1]，尤其是像4環芘一樣的高分子量多環芳烴很難被氧化降解，對生態環境和人類健康造成極大的威脅[2-3]。目前微生物修復被認為是治理PAHS污染的最具潛力的修復方法[4]。但是研究工作已經從單一篩選能夠降解PAHS的微生物轉變為基因調控機制、代謝途徑和高效工程菌的研究[5-6]。本實驗采用富集培養的方法從海洋紅樹林表層沉積物中篩選出多環芳烴芘的降解菌群，提取其質粒并導入至大腸桿菌DH5α中，馴化篩選出降解芘的高效基因工程菌群[7]，并進一步探討了該菌群和質粒的降解機制，進而為芘的微生物修復提供重要的科學依據[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣采樣于海洋紅樹林區的表層沉積物。

芘購置于Sigma-Aldrich 公司；二氯甲烷、甲醇(色譜純)購置于江蘇漢邦科技有限公司。

海洋細菌培養基：磷酸高鐵0.01 g；酵母浸膏1 g；蛋白胨5 g，加陳海水定容至1 L，pH 7.6～7.8。

無機培養基(MSM，mg/L)： MgSO4·H2O(200)； Na2HPO4(800)；(NH4)2SO4(1000)；CaCl2·2H2O(100)；(NH4)6M0O24·4H2O(1)；FeCl3·6H2O(5)；KH2PO4(200)；pH值為7.2，121℃，滅菌15 min。

芘母液：芘溶解于丙酮并定容為濃度5 mg/mL的母液，經0.22 μm尼龍膜過濾后封口避光保存。

PYR-MSM培養基：依據不同的芘終濃度(50～500 mg/L)，移取一定體積的芘母液到無菌的無機培養基中，過夜待丙酮揮發后使用。

1 .2 實驗方法

1.2.1 環境樣品的富集培養

分別稱取10 g新鮮紅樹林表層沉積物樣品和8 g無菌小玻璃珠，置于盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，25℃，150 r/min恒溫震蕩3 h[9]。靜置30 min后，移取5 mL上清液至45 mL新配置的以芘為唯一C源與能源的PYR-MSM培養基中(芘終濃度為100 mg/L)。25℃，150 r/min，繼續避光振蕩培養，每3 d觀察錐形瓶中培養液的顏色和濁度的變化。一個月后，轉接5 mL的上層培養液到新配制的45 mL PYR-MSM培養基中(200mg/L)，富集馴化培養一個月，再梯度增加芘濃度重復以上步驟；如此共富集馴化培養5個月，獲得能夠將500 mg/L芘作為唯一C源與能源的降解菌群[10-11]。

1.2.2 質粒的提取

選用本實驗室的改良方法：移取1.5 mL芘降解菌群 YL液體培養菌液至已滅菌的離心管中，在4℃下12 000 r/min離心30 s，棄上清(盡可能吸干培養液)。加入TAE渦漩振蕩洗滌菌體，4℃下10 000 r/min離心收集菌體沉淀，加入100 μL TAE充分混勻菌體，室溫靜置5 min；加入300 μL冰預冷的 SolutionⅠ(50 mmol/L Tris-Hcl，3(SDS，PH 值為12.61)，混勻，65℃水浴8-12 min至液體清亮；加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，輕柔顛倒混勻；4℃下12 000 r/min離心10 min；吸取上清液至5 mL離心管中，加入兩倍體積冰預冷的無水乙醇，4℃下靜置30 min，12 000 r/min，離心10 min，棄上清，倒扣離心管在吸水紙上，吸干液體。1 mL 70%乙醇洗滌1次，4℃下12 000 r/min，離心1 min，棄上清液，將離心管平放、開蓋置于37℃烘箱中干燥。加入20 μL無菌去離子水-20℃保存[10-11]。

1.2.3 感受態細胞制備和轉化

移取30 μLE.coliDH5α菌液，接種于3 mL LB液體培養基中，37℃、200 r/min恒溫培養3 h；將上述培養液平均分裝至2支離心管中，于4℃下4000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清液；振蕩使菌體懸浮于1 mL冰預冷的100 mmol/L CaCl2溶液，以臺式高速離心機最大轉度離心30 s，棄上清，每管加入100 μL冰預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液并輕緩懸浮細胞，4℃冰箱放置16 h后使用效果最好，可保存一周。移取2 μL本實驗室改良方法提取的質粒反應液于50 μL感受態細胞中，輕柔轉動混勻并冰浴30 min后，放入42℃水浴中熱擊90 s，立即放冰上2min。每管加入450 μL SOC培養基，37℃復蘇60 min。

1.2.4 降解芘質粒的篩選與鑒定

移取30 μL質粒轉化菌液，接種于芘濃度為0.1 mg/L的PAHs-LB培養基中，37℃，150 r/min避光培養過夜。取2 mL質粒轉化菌液至18 mL PAHs-MSM培養基(芘濃度為50 mg/L)中，25℃，150 r/min，避光培養，定期觀察三角瓶中培養液的顏色和濁度的變化。一個月后，轉接2 mL的上層液至新配制的18 mL PYR-MSM培養基中(芘終濃度為100 mg/L)，避光富集馴化一個月，再梯度增加芘濃度重復以上步驟；如此富集馴化培養共進行5個月，獲得能夠以芘為唯一C源與能源的質粒轉化菌群。

分別移取原大腸桿菌E.coliDH5α及經誘導含降解芘基因的質粒轉化菌，接種至PAHs-MSM培養基中(50 mg/L)，25℃，150 r/min避光培養，每3 d取樣1次。

1.2.5 芘降解菌群YL和質粒轉化菌對芘降解效果的測定

移取芘降解菌群YL和質粒轉化菌液至海洋細菌培養基上培養50 h，離心收集菌體，振蕩使菌體懸浮于MSM培養液，離心，再重懸去除海洋細菌培養基中的碳源，移取相同體積的菌液至新配制的20 mL PYR-MSM培養基(50 mg/L)中，25℃，150 r/min振蕩避光培養。每3 d取1次樣，共取樣7次。21 d后，在培養液中以鹽酸調pH值為2并加入二氯甲烷，40°C以下超聲萃取振蕩30 min。后用分液漏斗萃取2次并定容。取2 mL樣品用0.22 μm尼龍膜過濾后，于Agilent高效液相色譜儀檢測。設未加菌的PYR-MSM (50 mg/L)為空白對照。進樣量20 μL，流量1 mL/min，流動相為甲醇/Mllli-Q水(90∶10)，柱溫30℃，檢測波長為239 nm。 Agilent化學工作站進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 從紅樹林沉積物中富集分離芘降解菌群

細菌在降解多環芳烴過程中會釋放某種或某些中間產物，使培養液的顏色發生一定的變化[12]。Grifoll等發現多環芳烴在降解去除過程中會產生一些橙黃色物質，培養液的顏色隨即發生變化，同時水相由澄清變渾濁，表明存在以 PAHs為碳源的降解菌株[13]。在我們的研究中，環境樣品加入唯一碳源和能源——芘進行富集培養，經過1個月的馴化培養后，培養液顏色由乳白色(無機培養基加入一定濃度芘后會由無色透明轉變為乳白色)→白色混濁→淡黃色有絲狀條帶→穩定不變；在隨后4個月的富集馴化過程中，均可看到上述顏色變化且變化所需時間間隔逐漸縮短。表明隨著PAHs接觸時間的延長，微生物生長的延滯期逐漸縮短，培養液中的微生物及其酶體系已適應高濃度芘存在的環境且降解能力在增強，其混合微生物可以利用芘作為生長基質繁殖生長。

2.2 芘降解菌群YL對多環芳烴的降解

圖1 芘降解菌群YL對多環芳烴芘的降解曲線Fig 1 The degradation curve of pyrene by YL

芘降解菌群YL在21 d內對芘的降解率如圖1所示。在0～6 d內，芘降解率處于較低的水平，推測菌群剛投放至高濃度芘的環境時，受到芘的脅迫與毒害，菌體利用外源底物需用一定的時間，因而顯示出較低的降解率。從第7天開始，芘降解的幅度增大，可能是因為菌群已適應培養環境并利用其中某種細菌的降解中間產物作為營養物質，同時已被馴化利用芘作為碳源與能源。從第15天開始，芘降解出現停滯期，其后雖然繼續降解，但速率相當緩慢。原因可能是隨著培養基中的芘數量減少，使C源不足，降解過程中產生的某些中間代謝產物抑制細菌對芘的進一步利用，這有待于進一步的研究考證。在培養的第21天，測定培養液中剩余的芘濃度為3.95 mg/L，相應的降解率92.09%；空白對照瓶中芘的回收率達到92.9%以上，表明非生物因子對芘降解的影響很小，可視為對照樣無變化。說明芘降解菌群YL中存在著能很好地利用芘作為底物的微生物。

2.3 轉化菌的芘降解能力

2.3.1 降解芘質粒的篩選與鑒定

PAHs在降解過程中會產生某種或某些中間產物，使培養液的顏色發生變化。質粒轉化菌在富集培養的前2個月未像芘降解菌群YL發生顏色變化，第3個月后，顏色由乳白色→白色混濁→粉紅色伴有絲狀沉淀→穩定不變，表明帶有降解基因的質粒轉化菌需要一定時間適應環境并誘導產生相應的酶后，才可以利用芘作為唯一碳源和能源生長。

在芘含量為50 mg/L的無機培養基中加入原大腸桿菌E.coliDH5α及馴化得到的質粒轉化菌，兩者對芘的降解率的結果如表1所示，培養21 d后，質粒轉化菌培養液中芘含量由50 mg/L下降到7.155 mg/L，相應降解率為85.69%，而對照物受體菌E.coliDH5α的芘去除率僅為2.01%。由此表明質粒轉化菌具有不俗的芘降解能力，攜帶芘降解基因的重組質粒已成功轉化進E.coliDH5α，并穩定地發揮降解作用。

表1 質粒轉化菌與大腸桿菌DH5α芘降解率的對比Table 1 The comparison of the degradation rate of pyrene by DH5α and the transformed bacteria

2.3.2 質粒轉化菌對芘的降解

圖2 轉化菌對芘的降解曲線Fig 2 The degradation curve of pyrene by the transformed bacteria

相比于降解菌群YL降解芘的情況，質粒轉化菌的降解趨勢不一樣，在剛投放時，質粒轉化菌的適應期縮短了近一半，而且即使是在適應期也具有一定的降解作用；在第3～6天，降解幅度最大；在培養的第6天，測定培養液中剩余芘的濃度為29.40 mg/L，相應的降解率為41.2%；7～18 d，芘的降解幅度逐漸減小并在18～21 d時趨于平緩。原因可能是隨著芘的消耗，過低濃度的芘不利于與質粒轉化菌的充分接觸，使得可利用的碳源與能源減少，受芘誘導產生的酶量也相應減少，芘降解受到一定的抵制，這有待于進一步研究考證。最后第21天，測定培養液中剩余的芘的濃度為7.155 mg/L，相應的降解率為85.69%；而未加菌液的對照瓶中芘的回收率達到90%以上，非生物因子對多環芳烴芘的降解影響很小，仍可視為對照樣無變化。說明質粒轉化菌能夠利用芘作為唯一的碳源與能源并繁殖生長。質粒轉化菌具有不俗的降解芘的能力，其重組質粒上攜帶降解芘的基因。

3 結論

目前研究表明，負責PAHS降解的基因簇有的位于染色體上[14]，有的位于質粒上[15-16]，能夠降解多環芳烴的代謝酶通常是由細菌的質?；蚓幋a的[17]。本課題通過比較受體菌大腸桿菌與質粒轉化菌的芘降解率,表明與多環芳烴降解有關的基因位于芘降解菌群的內生質粒上，并且通過導入質粒的方法成功地創造出具有不俗降解能力的新菌株。為利用重組工程菌進行多環芳烴的生物修復奠定理論基礎與實驗基礎[18-19]。

[1]HUA F，WANG H．Uptake modes of octadecane byPseudomonassp.DG17 and synthesis of biosurfactant [J]． Journal of Applied Microbiology，2012，112(1):25-37.

[2]陳遠志.Mycobacteriumsp.WY10的特性及其對菲和芘的降解研究[D].杭州：浙江大學.2017：1-7.

[3]劉 鑫，黃興如，張曉霞,等.高濃度多環芳烴污染土壤的微生物-植物聯合修復技術研究[J].南京農業大學學報，2017，40(4): 632-640.

[4]BOURGUIGNON N，ISAAC P，ALVAREZ H，et al．Enhanced polyaromatic hydrocarbon degradation by adapted cultures of actinomycete strains [J]．Journal of Basic Microbiology，2014，54(12):1288-1294.

[5]GUZIK U，HUPERT-KOCUREK K，SITNIK M，et al．High activity catechol 1，2-dioxygenase fromStenotrophomonasmaltophiliastrain KB2 as a useful tool in cis-muconic acid production [J]．Antonie van Leeuwenhoek，2013，103(6): 1297-1307.

[6]CHEN K，ZHU Q，QIAN Y G，et al． Microcalorimetric investigation of the effect of non-ionic surfactant on biodegradation of pyrene by PAH-degrading bacteriaBurkholderiacepacia[J]． Ecotoxicology and Environmental Safety，2013,98(12): 361-367.

[7]VERDIN A，SAHRAOUI A L H，DURAND R．Degradation of benzo[a]pyrene by mitosporic fungi and extracellular oxidative enzym[J]．International Biodeterioration & Biodegradation，2004，53(2): 65-70.

[8]KONECKA E，BARANEK J，BIELINSKA I，et al．Persistence of the spores ofB．thuringiensissubsp． kurstaki from Foray bioinsecticide in gleysol soil and on leaves [J]． Science of the Total Environment，2014,472(8): 296-301.

[9]周作明，鄭 娜，方柏山.活性污泥馴化過程中芘降解菌的群落多樣性分析[J].湖南農業大學學報(自然科學版), 2009,35 (6): 694-698.

[10]許曉毅，蘇 攀，姬 宇，等.沉積物中 2 株多環芳烴降解菌的分離鑒定及其對菲、熒蒽的降解特性[J].環境工程學報, 2009,9(3):1513-1520.

[11]蔡麗希，許桂芬.芘降解質粒提取方法的研究[J].生物技術通報，2009,202(5): 92-95.

[12]魏 妍,楊嬌艷,王文玲，等.多環芳烴降解菌的篩選及其對天然水的凈化效果分析[J].化學與生物工程，2010, 27(12):56-60.

[13]張宏波, 林愛軍, 劉 爽，等.芘高效降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J].環境科學, 2010,31(1):243-248.

[14]SATIO A，IWABUCHI T，HARAYAMA S．A novel phenanthrene dioxygenase fromNocardioidessp． strain KP7: expression inEscherichiacoli[J]． Journal of Bacteriology，2000, 182(8):2134-2141.

[15]CHO J C，KIM S J.Detection of mega plasmid from polycyclic aromatic hydrocarbon-degradingSplingomonassp.strain 14[J].Microbiol Biotechnol，2001, 3(4):503-506.

[16]TANG S Y, BAI J Q，YIN H，et al． Tea saponin enhanced biodegradation of decabromodiphenyl ether byBrevibacillusbrevis[J]．Chemosphere，2014, 114: 255-261.

[17]宋 蕾，王 慧，施漢昌，等.1,2,4-三氯苯降解菌的分離及其降解質粒的研究[J].中國環境科學，2005,25(4)：385-388.

[18]WOJCIESZYNSKA D，HUPERT-KOCUREK K，JANKOWSKA A，et al.Properties of catechol 2，3-dioxygenase from crude extract ofStenotrophomonasmaltophiliastrain KB2 immobilized in calcium alginate hydrogels[J]． Biochemical Engineering Journal，2012：66(6): 1-7.