CD44基因多態性對原發性肝癌細胞局部T細胞亞群浸潤的影響*

苗鳳華，陳曉，石磊，馬筱慧

（吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春 130021）

原發性肝癌是中老年人的常見病[1]，預后較差[2-4]。CD44是近些年研究較熱的一個腫瘤標志物[5-8]，其可與組織間隙中微靜脈末端的高柱狀內皮細胞表面的透明質酸結合，在淋巴細胞回歸到黏膜和引流淋巴結中具有重要作用。CD44蛋白可以募集CD8+T細胞等向局部組織轉移，而CD8+T細胞可以分化為細胞毒性T細胞，因此可能增強機體對腫瘤細胞的殺傷作用。但目前關于CD44基因多態性與原發性肝癌患者局部組織中T細胞亞群的相關性尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性收集2017年1月-2017年12月吉林大學第一醫院收治的原發性肝癌患者臨床資料。納入標準：原發性肝癌（確診依據為病理診斷）；有手術適應證，可行手術治療；年齡18～75歲；同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標準：合并其他惡性腫瘤；復發性肝癌；肝﹑腎﹑心﹑腦﹑肺等重要臟器功能不全；感染性疾??；血液系統疾??；凝血功能障礙；術前接受新輔助化療等特殊治療；3個月內曾使用免疫調節劑；免疫功能不全；遠處轉移，不宜行手術治療的晚期肝癌患者。研究期間共納入原發性肝癌患者109例，根據CD44基因rs4756195位點單核苷酸多態性，將患者分為AA組﹑AG組和GG組，分別為67﹑23和19例。

1.2 觀察指標

主要觀察指標為腫瘤組織中CD4+T細胞﹑CD8+T細胞﹑Treg細胞﹑Th17細胞。次要觀察指標為白介素 -2（interleukin-2, IL-2）﹑白介素 -10（interleukin-10,IL-10）﹑腫瘤生長因子-β（tumor growth factor-β,TGF-β）和白介素-17（interleukin-17, IL-17）。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術 術中留取原發性肝癌組織標本（距離肝癌邊緣＞1 cm的肝癌組織），使用流式細胞儀（美國Beckman coulter公司Epics XL型）檢測CD4+T﹑CD8+T﹑Treg及Th17細胞。

1.3.2 免疫組織化學法 采用免疫組織化學法檢測IL-2﹑IL-10﹑TGF-β和IL-17，相關單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，抗體比例1∶80。陽性判定標準：根據染色強度和陽性細胞百分比計算，其中不著色﹑淺黃色﹑棕黃色﹑黃褐色分別為0﹑1﹑2和3分，陽性細胞數為＜10%﹑10%～＜40%﹑40%～＜70%﹑≥70%分別計0﹑1﹑2和3分，兩者之和為總分，總分≥2分為陽性，＜2分為陰性。

1.3.3 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR） 根據HapMap中國人數據庫，采用Haploview軟件。選定CD44基因rs4756195位點作為檢測位點，應用PCR確定個體基因型，相關試劑購自美國Santa Cruz公司。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計數資料以構成比表示，比較用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

3組患者年齡﹑性別﹑TMN分期﹑腫瘤直徑及分化程度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組患者一般情況比較

2.2 肝癌組織中CD4+ T和CD8+ T細胞的表達

2.2.1 CD4+T細胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者CD4+T細胞表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=5.873，P=0.003）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，AG組﹑GG組患者CD4+T細胞表達水平低于AA組（P＜0.05）；AG組與GG組患者CD4+T細胞表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2.2 CD8+T細胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者CD8+T細胞表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=6.175，P=0.001）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，AG組﹑GG組患者CD8+T細胞表達水平低于AA組（P＜0.05）；AG組與GG組患者CD8+T細胞表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 肝癌組織中Treg和Th17細胞的表達

2.3.1 Treg細胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者Treg細胞的表達水平比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=7.546，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，AG組﹑GG組患者肝癌組織中Treg水平高于AA 組（P＜0.05）。見表 3。

2.3.2 Th17細胞 AA組﹑AG組﹑GG組患者Th17細胞的表達水平比較，經方差分析，差異無統計學意義（F=1.985，P=0.378）。見表 3。

表2 3組患者肝癌組織中CD4+ T和CD8+ T細胞表達水平比較 （%，±s）

表2 3組患者肝癌組織中CD4+ T和CD8+ T細胞表達水平比較 （%，±s）

AA組（n =67） 21.08±2.12 28.83±2.52 AG組（n =23） 19.43±1.98 25.52±2.71 GG組（n =19） 19.12±2.09 24.91±2.29 F值 5.873 6.175

表3 3組患者肝癌組織中Treg和Th17細胞表達水平比較 （%，±s）

表3 3組患者肝癌組織中Treg和Th17細胞表達水平比較 （%，±s）

AA組（n =67） 6.12±1.47 1.64±0.42 AG組（n =23） 8.12±1.71 1.54±0.38 GG組（n =19） 8.24±1.92 1.55±0.37 F值 7.546 1.985

2.4 肝癌組織中IL-2、IL-10、TGF-β及IL-17的陽性表達

AA組﹑AG組﹑GG組 患 者 的 IL-2﹑IL-10﹑TGF-β陽性表達率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。3組患者IL-17陽性表達率比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 3組患者肝癌組織中IL-2、IL-10、TGF-β及IL-17的陽性表達率比較 例（%）

3 討論

腫瘤細胞的生物學特性決定腫瘤細胞的生長能力和轉移能力，對患者預后具有重大影響。醫學的進步雖然使原發性肝癌患者的死亡率有所下降，生存質量有所提高，但是其臨床預后仍不理想。目前已知原發性肝癌組織中免疫狀態對癌細胞的生長和轉移過程具有重大影響，多數肝癌組織中表現為免疫抑制狀態，為癌細胞的免疫逃脫提供了良好的條件。T細胞亞群是腫瘤組織中的重要免疫成分，良好的免疫功能狀態可以有效殺滅腫瘤細胞，抑制其生長和轉移。目前研究較熱的腫瘤相關的T細胞亞群主要包括CD4+T﹑CD8+T﹑Treg和Th17細胞。研究證實，在原發性肝癌患者中上述T細胞亞群功能失衡，例如Treg細胞升高，可以抑制免疫系統對肝癌細胞的殺傷作用[9-10]。

CD44基因rs4756195位點多態性對原發性肝癌患者的影響主要通過影響CD44蛋白的合成，從而發揮生理作用。CD44蛋白是一種細胞黏附分子，在腫瘤細胞和T細胞表面表達，主要通過結合細胞外基質，包括膠原蛋白﹑層黏連蛋白﹑硫酸軟骨素等，從而發揮其生理作用，介導淋巴細胞的歸巢﹑淋巴細胞向炎癥部位和黏膜相關淋巴組織歸位﹑黏附細胞外基質。CD44蛋白可以募集CD8+T細胞等向局部組織轉移[11-12]。而CD8+T細胞可以分化為細胞毒性T細胞，其是殺傷腫瘤細胞的重要免疫細胞[13-14]，因此可能增強機體對腫瘤細胞的殺傷作用。另外，CD44還可以通過促進T細胞向抗原呈遞細胞遷移﹑增強T細胞與抗原呈遞細胞的反應，發揮抗腫瘤效應；其還可以通過調節TCR/CD復合體信號通路，以T細胞活化的共刺激因子身份，參與T細胞的活化。最后，CD44還可以通過延長T細胞的壽命，發揮抗腫瘤細胞效應。目前尚無研究探討CD44基因rs4756195位點多態性與肝癌組織中T細胞亞群相關性的報道。本研究結果顯示，CD44基因rs4756195的多態性分布與原發性肝癌組織中T細胞亞群的分布有關，表現為CD44 rs4756195基因型為AG﹑GG的野生型患者CD4+T﹑CD8+T細胞表達降低，Treg升高，IL-2降低，而TGF-β﹑IL-10升高。IL-2是促炎因子，由活化的免疫性T細胞分泌，又可刺激T活性細胞的募集和增殖；TGF-β﹑IL-10則是免疫抑制因子，可以抑制體內炎癥反應。IL-2降低，TGF-β﹑IL-10升高表明機體處于一種免疫抑制狀態，提示原發性肝癌組織中CD44 rs4756195基因型為AG﹑GG的野生型患者局部免疫抑制狀態更嚴重。在結腸癌肝轉移﹑原發性肝癌等患者中，也證實CD44基因的多態性對腫瘤的生物學特性有重要影響[15-19]。我國學者周鑫等[20]在乳腺癌的研究中也證實，CD44 rs4756195基因型為AG﹑GG的野生型人群更容易發生乳腺癌，且發展更快，預后更差。

綜上所述，原發性肝癌患者CD44基因rs4756195位點呈多態性分布，與肝癌組織中的免疫抑制有關。

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