百香柿子果醋飲料的研制

王從從，石磊，萬守朋，曹珊，張仁寬，鄭宇

（1.天津市利民調料有限公司，天津300308；2.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

柿子是我國常見的果品，成熟的柿果色澤鮮艷、味甜多汁，具有較高的營養和藥用價值。每100 g柿果可食部分約含蛋白質0.67 g、脂肪0.1 g、碳水化合物16 g～20 g、鈣 10 mg、磷 19 mg 、鐵 0.2 mg。此外還含有單寧酸、胡蘿卜素、黃酮及瓜氨酸、無色花青素等功能物質[1]。中醫認為柿子有清熱、止咳、潤肺、健脾、止痢、涼血、解酒毒等功效[2]。由于柿子的加工技術落后，目前市場上柿子的加工品種十分單調，除了帶白霜的柿餅外，很少見到其它柿子加工品[3]。近年來隨著人們生活水平的提高和生產技術的進步，以水果作為原料生產的果醋及果醋飲料由于其風味獨特，且具有一定的保健功能受到市場的青睞，消費量逐年攀升[4]。開發新型果醋，是一個提高經濟效益和社會效益非常有效的途徑[5]，我國農產品的深加工。目前市場上所見的果醋品種單一，主要以蘋果醋及其飲料為主，以柿子為原料發酵生產果醋，不僅可以充分開發利用柿子資源，還可以滿足消費者對于飲料產品多樣化的要求，具有顯著的社會效益和經濟效率。

百香果，香味濃郁、口感獨特，素有“飲料之王”的美稱。楊鋒[6]等對百香果進行了加工適性的測定研究，研究表明百香果營養成分豐富，出汁率達43.33%，可溶性固形物16.5%，具有較好的熱穩定性，是一種優質的果汁加工原料[7]。另外百香果還具有很高的營養價值和藥用價值。它含有豐富的生物活性成分，主要包括多酚類，如芹菜素、葒草素、槲皮黃酮等，生物堿等[8-9]。它具有抗焦慮、鎮靜、抗炎等作用，此外，還具有降血糖、降血脂等生理功效[10-12]。

本論文以柿子為原料，發酵生產柿子醋，同時為了改善柿子果醋風味單一的缺點，以柿子原醋為基礎，采用百香果汁進行調配，利用響應面法對柿子果醋、百香果、白砂糖的添加量進行優化，開發混合果汁果醋飲料產品。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柿子：產自天津薊縣；百香果：產自云南??；中溫型α-淀粉酶（2.0×103U/g）、纖維素酶（1.8×103U/g）、果膠酶（6.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（2.0×103U/g）：天津濱海諾奧酶工程技術有限公司；亞硫酸：天津市大茂化學試劑廠；碳酸氫鈉：天津市福晨化學試劑廠；檸檬酸：天津市北方天醫化學試劑廠；硅藻土：天津市化學試劑三廠；果酒專用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌Acetobacter pasteurianus AC2005：中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC 3089。

1.2 主要設備

醫用凈化臺：蘇州凈化設備廠；電熱恒溫培養箱：天津市實驗儀器廠；電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；回旋式恒溫調速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設備有限公司；離心機：北京醫用離心機廠；紫外分光光度計：蘇州島津儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器：江蘇榮華儀器；生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所。

1.3 柿子果醋飲料工藝流程

1.4 試驗方法

1.4.1 柿子酒的制備

1.4.1.1 柿子酒的制備方法

將柿子果實進行分選清洗破碎，加入亞硫酸稀釋液、纖維素酶、果膠酶，中溫型α-淀粉酶稀釋液攪拌混合均勻，置于50℃恒溫水浴中酶解大約2 h后，酶解期間每0.5 h攪拌翻動一次。加入木瓜蛋白酶稀釋液攪拌混合均勻繼續置于55℃恒溫水浴中酶解0.5 h，取出后迅速冷卻到室溫，得到柿子果漿；將柿子果漿經120目濾布過濾得到柿子果汁。分別向柿子果漿和柿子果汁中加入適量檸檬酸調整pH值至酵母菌生長最適pH為4.5，加入葡萄糖調整含糖量至200 g/L～220 g/L左右。將兩組試驗分別按照接種量2 g/kg（以活性干酵母粉質量計）接種酵母菌，在25℃條件下密閉發酵。待發酵液中還原糖含量基本穩定、氣泡消失即視為發酵結束，終止發酵。將果漿組發酵液過12目濾布去除發酵后殘留的果渣和酒腳。通過測定兩組試驗最終酒精度、糖度、多酚、氨基肽氮含量，確定最佳的酒精發酵原料。

1.4.1.2 柿子酒相關指標的檢測方法

總糖的測定按照GB/T 5099.7-2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》?？偹岬臏y定按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》?？偡拥臏y定參照牛雪[13]等人的方法。氨基酸態氮的測定按照GB/T 18186-2000《釀造醬油》。酒精度的測定按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.2 柿子醋制備

1.4.2.1 醋酸菌種子液制備

種子培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏15，自然pH值，121℃滅菌20 min，接種前加入無水乙醇至28 g/L。

刮取斜面試管中保存的菌體兩環，接入到種子培養基中。30℃，培養27 h，至OD610為1.5，酸度1.2 g/100 mL以上。

1.4.2.2 柿子醋發酵條件優化

查閱文獻得出發酵溫度、接種量、初始乙醇濃度、初始酸度這4個條件為影響醋酸發酵的主要因素，并結合前期試驗結果各選擇3個水平對4個發酵條件進行優化。

最佳發酵溫度的確定：設置發酵溫度為28、30、32℃，在適宜條件下培養，檢測發酵液中的產酸量，以確定最佳發酵溫度。

最佳接種量的確定：利用得到的最佳發酵溫度，設置接種量為5%、10%、15%，檢測發酵液中的產酸量，以確定最佳接種量。

最佳初始乙醇濃度的確定：利用上述得到的最佳發酵條件，設置發酵初始乙醇濃度位7%、8%、9%，檢測發酵液中的產酸量，以確定最佳初始乙醇濃度。

最佳初始酸度的確定：利用上述得到的最佳發酵條件，設置初始酸度為0.5%、1%、1.5%，檢測發酵液中的產酸量，以確定最佳初始酸度。

上述4個單因素分別記作A、B、C、D進行四因素三水平正交試驗，見表1。

表1 試驗因素水平Table 1 Experimental factors and levels

1.4.2.3 柿子醋的澄清

柿子果醋中加入5%的明膠，恒溫振蕩培養箱170 r/min 振蕩 1 h，進行澄清、除澀[14]。

1.4.3 柿子醋飲料調配

依據感官品評方法，結合單因素試驗進行三因素三水平優化試驗，確定柿子果醋、白砂糖、百香果汁調配比例。利用Design-Expert設計BOX-Behnken試驗，以感官評分作為響應值，通過回歸方程構建擬合因素與響應值的函數關系，尋求最優的變量組合，其因素編碼水平如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗因素及水平Table 2 Box-Behnken experimental factors and levels

1.4.4 分析方法

邀請10名具有品評經驗的人員，對不同調配下的百香柿子果醋飲料進行感官品評，評價指標分為色澤，香氣，口感，體態4個方面總分10分，見表3。

2 結果與分析

2.1 柿子酒發酵原料的比較

柿子酒的品質直接決定柿子醋的品質，本論文比較了柿子果漿發酵酒和柿子果汁發酵酒的5種理化指標，如表4所示。

表3 感官評分標準Table 3 Criteria for sensory evaluation

表4 柿子果漿發酵酒和果汁發酵酒的比較Table 4 Comparison of persimmon wine with mash or must

利用果漿發酵制作柿子酒發酵結束后酒中總糖含量低于果汁發酵酒，同時果漿酒酒精度高于果汁酒，這可能由于柿子果皮和果肉中含有較多的營養物質促進了酵母的生長從而導致果漿酒酒精度較果汁酒高。另外果漿酒中的多酚含量明顯高于果汁酒，提高了柿子酒的抗氧化能力，增強了產品的保健效果[15]，兩種原料生產的總酸和氨基酸態氮含量相差不大。最終確定利用果漿發酵酒進行醋酸發酵。

2.2 柿子醋發酵工藝優化

2.2.1 溫度對柿子醋發酵的影響

溫度是影響微生物繁殖的重要因素之一，在一定溫度范圍內微生物的生長繁殖隨著溫度的上升而增加，過高的溫度會在醋酸發酵中增加酸對菌體的傷害[16-17]。將柿子果漿酒置于不同的溫度下進行醋酸發酵，溫度設置為：28、30、32℃，見圖 1。

如圖1所示，在30℃條件下巴氏醋桿菌AC2005發酵產酸速率最快，該菌株最適的發酵溫度為30℃。

2.2.2 接種量對柿子醋發酵的影響

接種量的大小直接影響發酵時間，增大接種量可以縮短發酵周期，但接種量過大時，菌體容易過早衰老，影響發酵效率[15]，見圖 2。

圖1 溫度對柿子醋發酵的影響Fig.1 Effect of temperature on the persimmon vinegar fermentation

圖2 接種量對柿子醋發酵的影響Fig.2 Effect of inoculation volume on persimmon vinegar fermentation

如圖2所示，5%接種量相對于10%和15%接種量產酸量低，10%和15%接種量，最終產酸無明顯區別，從節約成本方面考慮最終確定10%接種量為醋酸發酵最優接種量。

2.2.3 初始乙醇濃度對柿子醋發酵的影響

乙醇是醋酸菌發酵的底物，但過高的乙醇濃度對醋酸菌的生長有抑制作用[18]，見圖3。

圖3 初始乙醇濃度對柿子醋發酵的影響Fig.3 Effect of initial alcohol concentration on persimmon vinegar fermentation

如圖3所示，8%的乙醇沒有對醋酸菌產酸及生長有影響，且發酵效率高于7%初始乙醇濃度，而9%的乙醇則抑制了醋酸發酵，因此確定初始乙醇濃度為8%，搖瓶發酵產酸達（5.3±0.08）g/100 mL。

2.2.4 初始酸度對柿子醋發酵的影響

課題組前期研究表明，初始發酵條件下適宜的酸度會促進醋酸發酵的產酸速率和菌體的活性，過高的酸度會脅迫細胞質pH值的降低，導致一些相關的酸敏感糖分解酶的活性喪失（嚴重影響產生ATP的能力）和細胞膜、大分子物質（如DNA和蛋白質）的結構損壞[19]，見圖 4。

圖4 初始酸度對柿子醋發酵的影響Fig.4 Effect of initial acid concentration on persimmon vinegar fermentation

如圖4所示，1%的初始乙酸會促進醋酸菌產酸及生長使發酵效率高于0.5%初始乙酸濃度，而1.5%的初始乙酸則會抑制醋酸菌菌體生長和發酵產酸效率。

2.2.5 正交試驗

通過單因素試驗得到的溫度（A）、接種量（B）、初始乙醇濃度（C）、初始酸度（D）4個對產量影響較大的因素，以最佳數據左右相鄰的數據作為各因素的3個水平進行正交試驗設計L9（34），結果如表5所示。

表5 正交試驗L9（34）Table 5 The orthogonal experiment

續表5正交試驗L9（34）Continue table 5 The orthogonal experiment

由表 4 可以看出：RA＞RD＞RC＞RB，即對柿子醋發酵產酸的影響：溫度＞初始酸度＞初始乙醇濃度＞接種量。同時由K值結果還可以得出最優發酵條件為A2B2C2D2，由于該組合并未在正交試驗中出現，為了進一步驗證結果，進行驗證性試驗，即按照組合A2B2C2D2進行柿子醋發酵試驗，得到的最終酸度為5.94 g/100 mL，且酸度和得分為所有組合中最高。所以最優組合為A2B2C2D2；即：30℃、接種量10%、初始乙醇濃度8%、初始酸度1%。以此條件進行后續的試驗。

2.3 響應面法優化百香柿子果醋飲料配方

2.3.1 柿子果醋添加量的確定

柿子果醋添加量對飲料風味的影響見圖5。

圖5 柿子果醋添加量對飲料風味的影響Fig.5 Effect of percentage of persimmon vinegar on beverage flavor

由圖5可知，當柿子原醋添加量大于10%時，醋酸味較重，酸度偏高，直接飲用口感刺激明顯，添加量過低則醋酸風味較低。果醋飲料中柿子醋的添加量在10%時，調配后的醋飲感官評分較高。

2.3.2 白砂糖添加量的確定

白砂糖添加量對飲料風味的影響見圖6。

從圖6可以看出白砂糖添加量在6%時感官評分較高，白砂糖添加量高于6%時，口感過于甜膩，掩蓋了醋飲料的酸味特點；添加量低于6%時，醋味的刺激較明顯，因此白砂糖添加量確定為6%。

2.3.3 百香果汁添加量的確定

百香果能夠賦予柿子醋飲料獨特的熱帶水果風味，且賦予了果醋金黃的色澤，不需要額外添加色素。百香果汁添加量少則果醋飲料的風味不足；添加量過多，則百香果風味過重，掩蓋了醋的風味，見圖7。

圖6 白砂糖添加量對飲料風味的影響Fig.6 Effect of percentage of sugar on beverage flavor

由圖7可知，柿子果醋飲料中的添加量在6%時調配后的飲料的感官評分最高。依據感官品評，結合單因素確定柿子原醋10%，白砂糖6%，百香果汁6%為較好調配比例，設計BOX-Behnken試驗，以感官評分作為響應值，優化柿子原醋（A）、白砂糖（B）、百香果汁（C）添加量。Box-Behnken試驗結果見表6，回歸模型系數及顯著性檢驗結果見表7，回歸方程方差分析見表8。

表6 Box-Behnken試驗結果Table 6 Results of Box-Behnken experimental

續表6 Box-Behnken試驗結果Continue table 6 Results of Box-Behnken experimental

表7 回歸模型系數及顯著性檢驗結果Table 7 Regression coefficients and significance test for the constructed quadratic polynomial model equation

表8 回歸方程方差分析表Table 8 Analysis of variance for the regression equation

對數據進行分析得到感官評分Y響應面的回歸模擬方程：Y=9.20+0.28A+0.038B+0.76C-0.050AB+0.100AC-0.025BC-1.36A2-0.59B2-0.89C2。

由表7可知，模型項p＜0.000 1，說明Y與回歸方程的關系極為顯著，模型擬合較好，可信度極高。失擬差p=0.124 7＞0.05，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，殘差是隨機產生，模型符合實際情況，可以用此模型對感官品評進行分析，結果可靠。由表8可知，模型的相關系數R2=0.9924，校正系數R=0.982 5。說明模型可以解釋99.24%的感官品評，變異系數為1.85%，信噪比為28.630，試驗的可靠性高。

為了進一步研究相關因素之間的交互作用，優化調配比例，本試驗利用Design-Expert軟件對回歸模型進行響應面分析，得到相應的響應面立體圖等高線圖分析圖，見圖8。

圖8 各因素交互作用對感官品評的響應曲面及等高線圖Fig.8 Surface plots of combined effects of three factors on sensory

圖8 等高線可以看出，A與B，B與C，A與C均有交互作用，但交互作用不明顯。Y值隨著A、B、C因素的增加先增加后減小，另外從響應面圖可以看出，響應值Y存在最大值，及Y值越大，果醋飲料的口感越好，因而在優化標準上Y選取最大值。Design-Expert設計BOX-Behnken設計試驗對數據進行分析，通Y值方程求解可得A、B、C對應的試驗值為A=10.63，B=5.52，C=7.41，此條件下感官評分最高為9.3630。為了試驗方便將結果修正為柿子原醋10.5%，白砂糖為5.5%，百香果汁為7.5%。在修正條件下3次平行試驗，所得感官評分為9.02，與模型預測值相近，表明該結果能很好的預測實際情況。

3 結論

本試驗以柿子果漿為底物發酵制酒，得到酒精度為12.5%的柿子酒。以柿子酒為原料采用單因素試驗和正交試驗優化柿子果醋發酵工藝，得出最優發酵條件為A2B2C2D2，即：30℃、接種量10%、初始乙醇濃度8%、初始酸度1%。經驗證試驗，最終酸度為5.94 g/100 mL。以此果醋為主要原料，輔以百香果汁及白砂糖，研制新型果醋飲料。經響應面優化后柿子果醋飲料配方為：柿子果醋10.5%，白砂糖5.5%，百香果汁7.5%。最終飲料產品總酸度為（0.53±0.08）g/100 mL，總糖為 6.95%。其香味獨特，口感酸甜，清朗爽口，適合大眾飲用。

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