水產品中甲基睪酮殘留物檢測方法對比研究

黃鸞玉，韋信賢，童桂香，楊姝麗，吳祥慶，蒙源，吳明媛

（廣西水產科學研究院，廣西 南寧530021）

甲基睪酮（methyltestosterone，MET）是一種人工合成的類固醇類雄性激素，又稱甲基睪丸素和甲睪酮。由于MET藥效顯著且穩定，容易獲得，在漁業生產中已有50年使用史，育苗期間的使用尤為普遍。MET具有增強雄性體征和蛋白質同化的雙重作用，能提高飼料轉化率并促進動物生長[1]，育苗期間常通過藥餌投喂、浸浴幼魚等給藥方式來促進苗種性別轉變，提高個體增長速率，最終大幅度提高水產養殖經濟效益。MET在動物體內代謝緩慢，蓄積性強，通過食物鏈進入人體會產生嚴重的副作用，比如擾亂激素平衡、影響生育能力，致胎體中毒、致肝中毒和致癌等[2-4]，導致國人對水產品質量安全的信心下降，出口貿易頻遭綠色壁壘。因此，檢測水產品中MET殘留量尤為迫切。

目前水產品中MET的檢測方法有高效液相色譜法[5-8]、高效液相色譜-串聯質譜法[9-10]、氣相色譜-質譜法[11]、酶聯免疫法[12]、化學發光法[13]、毛細管電泳法[14]等。酶聯免疫法的缺點是易出現假陽性，只能用作初步篩查。液相色譜-質譜法儀器昂貴，不利于在各級檢測機構全面開展檢測工作。氣相色譜-質譜法需要對分析物進行衍生化，結果不穩定。相對而言，高效液相色譜法更能滿足日常檢測需求。中國水產行業標準正是采用液液萃取-高效液相色譜法測定水產品MET殘留物[8]。在日常檢測工作中，發現該方法凈化效果不好，儀器分析時間長，加標回收率偏低，不適合批量檢測，很有必要進行優化。本研究以中國水產行業標準SC/T3029-2006《水產品中甲基睪酮殘留量的測定》為基礎，對液相色譜法測定水產品中MET含量的兩種前處理方法及色譜條件的線性、精密度、回收率、穩定性、適用性等方面進行對比試驗，目的是尋找最合適檢測水產品中MET殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高壓液相色譜儀（ACQUITY UPLC）：美國Waters公司；高效液相色譜儀（Agilent1200）、固相萃取裝置：德國 Agilent公司；平行蒸發儀（Syncore Polyvap）：瑞士buchi公司；循環水冷卻器（H35）：萊伯泰科有限公司；多管架自動平衡離心（TDZ5-WS）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；往復式振蕩器（ZWF-334）：上海智城分析儀器制造有限公司；離心機（TD6M）：長沙平凡儀器儀表有限公司；固相萃取柱（poly-sery HLB，60 mg，3 mL）：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.2 試劑

MET標準物質（純度98%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；無水乙醚（分析純）：西隴化工有限公司；石油醚（色譜純）：國藥集團化學有限公司；甲酸、異丙醇（色譜純）：天津市光復精細化工研究所；酸化乙腈：乙腈-甲酸（199/1，體積比）。

檢測樣品按照《水產品抽樣方法》[15]的規定處理。

1.2 MET檢測方法

1.2.1 標準溶液配制

準確稱取MET標準物質10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配成100 μg/mL的標準溶液，-18℃存放。使用前用甲醇稀釋成5 μg/mL工作液，再分別移取適量工作液，用80%甲醇水溶液配成濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000、2.500 μg/mL 的標準工作曲線。

1.2.2 樣品制備

將供試樣品置于常溫條件自然解凍，取適量樣品制成細小、均勻的魚糜樣。

1.2.3 樣品提取與凈化

方法1：參照中國水產行業標準SC/T3029-2006《水產品中甲基睪酮殘留量的測定》，稍有改進。具體方法：稱?。?.00±0.05）g樣品置于 50 mL離心管中，加入15 mL無水乙醚，振蕩提取10 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至平行蒸發管中，再向離心管中加入10 mL無水乙醚，重復提取1次，上清液合并至蒸發管中，經40℃平行蒸發至干。用3 mL 80%的甲醇水溶液溶解殘渣，加入3 mL石油醚，旋渦混勻去脂，轉入10 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min。棄去石油醚層，取下層溶液過0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜儀測定。

方法 2：稱?。?.00±0.05）g樣品置于 50 mL離心管中，加入15mL酸化乙腈，勻漿30s，振蕩提取10min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至平行蒸發管中，再向離心管中加入8 mL酸化乙腈，重復提取1次，上清液合并至蒸發管中。向蒸發管中加入10 mL異丙醇，經55℃平行蒸發至干。用3 mL甲醇溶解殘渣，加入7 mL純凈水，混勻，轉入15 mL離心管中，放置冰箱冷凍30 min，6 000 r/min離心10 min。取甲醇溶液層通過預先用3 mL甲醇、3 mL水活化的HLB柱上樣，以小于2 mL/min的流速過柱，棄去濾液，用6 mL水淋洗，待淋洗液全部流出后抽HLB柱近干，棄去流出液，用4 mL 80%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，定容至4 mL，混勻，過0.22 μm微孔濾膜，供超高壓液相色譜儀測定。

1.2.4 色譜條件

1.2.4.1 高效液相色譜法

色譜柱：Luna 5u C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（78/22，體積比）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：254 nm。

1.2.4.2 超高壓液相色譜法

色譜柱：BEH C18 柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：甲醇-水（70/30，體積比）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：254 nm。

1.2.5 計算公式

以保留時間定性，峰面積定量，根據下式計算水產品MET的殘留量。

式中：C 為樣品中 MET 的含量，（μg/kg）；c為由標準曲線查得提取液中MET的含量，（μg/mL）；v為提取液定容體積，mL；n為稀釋倍數；m為稱樣量，kg。

2 結果與討論

2.1 數據的采集

2.1.1 高效液相色譜法

在高效液相色譜法的儀器條件下，用進樣器進20 μL濃度為1 μg/mL的標準溶液，再分別進20 μL經過方法1前處理后的空白樣品和加標濃度為100 μg/kg的加標樣品，根據其出峰時間定性，考察MET信號響應強度、溶劑雜質響應強度和樣品分離效果。結果見圖1。

由圖1可知，MET出峰時間為7.1 min～7.5 min。用無水乙醚作為提取劑，溶劑峰明顯高于目標峰。樣品圖譜復雜，目標峰附近雜峰多，容易干擾目標峰定性與定量分析。有研究表明，用石油醚、正己烷除脂時，兩種試劑均會對目標峰組分造成一定干擾[16]。因此，需要對方法1的提取劑及除脂方式進行優化。

圖1 高效液相色譜法圖譜Fig.1 Chromatograms of high performance liquid chromatography

2.1.2 超高壓液相色譜法

MET結構式中有極性的羥基、羧基和非極性的碳環[17]，易溶于乙腈，同時因為存在羥基，采用酸性條件更利于提取，因此，方法2選擇酸化乙腈來沉淀部分樣品蛋白質，提取MET。在超高壓液相色譜法的儀器條件下，用進樣器分別進5 μL濃度為0.1 μg/mL的MET標準溶液、經方法2前處理的空白樣品和100 μg/kg加標樣品提取液，色譜圖見圖2。

圖2顯示，MET出峰時間為3.8 min～4.2 min。用酸化乙腈作為提取劑，溶劑峰明顯降低。樣品經冷凍離心脫脂，再經HLB柱凈化，目標峰附近沒有雜峰，定性和定量分析均不受雜峰干擾。

圖2 超高壓液相色譜法圖譜Fig.2 Chromatograms of ultra-high pressure liquid chromatography

2.2 線性關系

將1.2.1所配的標準溶液分別用1.2.4的兩種色譜條件進行檢測，以峰面積對濃度做標準曲線，進行線性回歸分析。高效液相色譜法的標準曲線為Y=11.5723X-0.132 3，r=0.999 1，在 0.050 μg/mL～1.000 μg/mL 范圍內線性關系良好；超高壓液相色譜法的標準曲線為Y=70163.9X-117.2，r=0.9996，在 0.025 μg/mL～2.500 μg/mL范圍內線性關系良好。相關系數表明，超高壓液相色譜法有相對較寬的線性范圍。

2.3 檢出限

本試驗以3倍信噪比（S/N）對應的濃度計算方法檢出限，得到方法1的檢出限為10 μg/kg，方法2的檢出限為5 μg/kg。方法2降低了溶劑峰和基質干擾，檢出限明顯降低。

2.4 精密度試驗

取同一濃度的MET標準品，分別用兩種色譜條件平行測定5次，分別計算MET含量，考察精密度，結果列于表1。

表1 精密度試驗結果（n=5）Table 1 The precision experimental results（n=5）

兩種檢測方法的RSD均小于10%，均能滿足檢測需求。

2.5 加標回收率試驗

為考察兩種方法的準確度，以未檢出MET的羅非魚肌肉作為空白樣品，設計10、50、100 μg/kg的加標濃度，測定MET的回收率，每種方法每個加標濃度平行測定5次，結果見表2。

表2 不同方法MET回收率（n=5）Table 2 Rate of recovery in different methods（n=5）

由表2可知，方法1的回收率在70.0%～80.4%之間，測定值的相對標準偏差在4.2%～9.1%之間；方法2的回收率在81.2%～91.1%之間，測定值的相對標準偏差在2.3%～5.5%之間。在相同加標濃度下，方法2的平均回收率和精密度高于方法1。方法2的3個加標濃度的平均回收率均大于80%；方法1在其10倍檢出限濃度水平（100 μg/kg）下，才獲得80.4%的平均回收率，回收率偏低。

2.6 樣品檢測對比

取50個不同的水產品樣品，按照1.2.3的處理過程，同時采取兩種方法檢測，方法2前處理因要使用HLB柱凈化，需要0.7 h，冷凍脫脂需要0.5 h，比方法1前處理的時間長。方法2檢測出峰時間為4 min左右，儀器測試一個樣品需要7 min，而方法1儀器測試一個樣品需要15 min。儀器測試50個樣品方法2比方法1節約了約6.7 h。從整體檢測時間來分析，方法2更快捷。從檢測準確性來比較，方法2結果更穩定準確。

3 結論

通過對比研究，兩種方法線性相關系數均大于0.999 0，線性關系均良好，方法2檢測信號干擾較少，檢出限達到5 μg/kg，比方法1低1倍。方法2的回收率和精密度比方法1高，結果相對準確。方法2儀器分析流速為0.2 mL/min，比方法1節約流動相0.8 mL/min；方法2儀器分析時間較短，每進一個樣可以節約8 min。大批量進樣的時候，方法2可以節約數量可觀的流動相和分析時間，實用性強，更適合快速測定水產品中MET殘留物的含量。

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