產黃青霉對根皮素微生物轉化研究

賈秀娟，張晨曦，趙艷敏，劉岱琳，賀凌霜，晁亮

（1.中國人民武裝警察部隊后勤學院，天津300309；2.天津中醫藥大學，天津300193）

根皮素（Phloretin）化學名為3-（4-羥基苯基）-1-（2，4，6-三羥基苯基）-1-丙酮，主要分布于蘋果、梨等多汁水果的果皮及根皮中，具有降血糖、心血管保護、抗氧化、抗炎、免疫抑制和美白等多種藥理作用[1]，受到國內外學者廣泛關注。

根皮素具有豐富的生物活性，因此近年來很多學者專注于根皮素的結構改造研究。有學者利用化學合成的方法對根皮素的乙酰阿魏酸酯[2]、異煙?；闧3]和乙基醚化[4]等衍生物進行合成；也有學者利用生物酶對根皮素的生物轉化進行研究，獲得了一系列新的糖苷化產物[5]，但是利用微生物菌種對根皮素進行轉化的研究報道較少。本課題組前期從24種真菌中篩選出包括菌株AS3.521在內的4株真菌對根皮素具有轉化作用，在此基礎上通過對轉化底物根皮素消耗率的測定，發現這4株菌株的轉化效率也較高[6]。本期在前期工作基礎上系統研究菌株AS3.521對根皮素的轉化，研究結果對根皮素的生物合成和生物轉化提供可以借鑒的試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根皮素對照品（純度為90%）：天津市尖峰天然產物研究開發有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、無水乙醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司；超純水：天津市職業與環境危害仿制重點實驗室自制；DNA Marker、2×TaqMasterMix、引物 ITS1、引物 ITS4、ddH2O：北京博邁德生物技術有限公司；BIOWESTAGAROSE瓊脂糖：上海玉博生物科技有限公司；EB（Ethidium bromide）染料：北京全式金生物技術有限公司（TRANS）；菌株AS3.521：天然產物實驗室自有的菌種。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器：哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；SB-2000旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；SHB-ⅢS循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；FA1204B電子天平：上海精密科學儀器有限公司；高效液相色譜儀（檢測器：SPD-M20A，柱溫箱：CTO-20A，雙泵：LC-20A，控制器：CBM-20A）、泵：Shi madzu LC-6AD、Shimadzu PRC-ODS，40 mm×250 mm，5 μm：日本島津公司；Cosmosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：Nacalai Tesque；Bruker AV-400 核磁共振波譜儀、Bruker DRX-400 spectrometer（1H-NMR 400 MHz，13C-NMR 100 MHz）：布魯克公司；制備型高效液相色譜儀：紫外檢測器：UV3000：北京創新恒通科技有限公司；微量進樣器：TM#702 0.025 mL：美國Hamilton公司；Solarbio真菌基因組DNA提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；GeneAmp PCR System 9700 PCR儀：美國應用生物系統公司；離心機：賽默飛世爾科技有限公司；Bio-rad瓊脂糖凝膠電泳儀、Bio-rad照膠儀：北京伯樂生命科學發展有限公司；Olympus CKX41光學顯微鏡：日本OLYMPUS光學儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；高速振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DZKW-D-2電熱水浴鍋：北京永光明醫療儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的鑒定

將菌株接種于PDA平皿培養基上，在28℃恒溫培養箱中培養，待長出成型的菌落后，觀察記錄菌落的形態特征。

通過ITS序列分析進行分子生物學鑒定：取生長在斜面培養基中活化后生長狀態正確的供試菌株，刮取菌絲體50 mg～100 mg，利用Solarbio真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌種DNA，并應用通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和 ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）對提取得到的DNA進行 PCR擴增。PCR反應體系：25 μL2×Taq Master Mix，2 μLITS4 引物，2 μLITS5 引物，1 μLDNA以及20 μL ddH2O。反應過程：94℃預處理5 min，94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min；循環 30次，最后在72℃延伸10 min。PCR擴增結束后取5.0 μL PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，經ED染料染色后在PCR儀中進行觀察。將PCR產物委托上海派森諾生物科技股份有限公司進行測序，得到的測序結果在國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中 GenBank 中進行序列檢索并與Genbank中基因進行比對，通過生物軟件Mege7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）建立系統發育樹，進行菌種鑒定。

1.3.2 菌株AS3.521孢子菌懸液的配制

向保存于固體斜面培養基中的AS3.521菌株中加入無菌水，用接種環充分刮取菌體，通過紗布過濾，制成104CFU/mL的孢子菌懸液，備用。

1.3.3 菌株AS3.521的生長曲線的建立

利用微量移液槍吸取1 000 μL上述菌懸液接種到100 mL的液體牛肉膏培養基中，用8層紗布封好瓶口，放入全溫振蕩器中。在28℃，轉速為160 r/min下培養。每隔6小時或12小時取出一組空白培養瓶和加藥樣品瓶，搖勻后取出適量用紫外可見分光光度計在600nm下測定發酵液的OD值，每個樣品平行測定3次，繪制生長曲線。

1.3.4 菌株AS3.521對根皮素的轉化

每200 mL PDA液體培養基中加入2 mL1.3.2項下的孢子菌懸液，在28℃、160 r/min條件下培養48 h后，加入用70%甲醇溶解的根皮素溶液（10 mg/mL）6 mL，使得底物（根皮素）濃度為0.3 mg/mL，同時設置只加入6 mL甲醇溶液而無底物的發酵組作為對照組。在相同條件下繼續培養3天后，減壓抽濾，去除菌絲體后合并濾液即得轉化產物的培養液。

1.3.5 轉化產物的分離及結構鑒定

將累積的1.3.4項下的轉化產物培養液用等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮至干，得到浸膏 15.2 g，利用大孔樹脂 HP20（45 cm×3.7 cm）進行分離，以水，30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脫，得到 5 個梯度組分（組分 1～5）。組分 2（1.16 g）經硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0～94∶6，體積比）梯度洗脫，獲得5個洗脫組分（組分6～10）。其中組分8（105.7 mg）進行反相制備液相純化，甲醇-水（15 ∶85）洗脫獲得轉化產物 1（21.6 mg）。將組分 9（33.8 mg）進行反相制備液相純化，甲醇-水（15∶85，體積比）洗脫獲得轉化產物 2（1.4 mg）和轉化產物 3（1.8 mg）。所得轉化產物分別用氘代甲醇溶解，置于核磁管中，利用核磁共振儀進行碳譜、氫譜數據測定。

圖1 菌株AS3.521菌落形態Fig.1 The forms of strain AS3.521

2 試驗結果

2.1 菌株AS3.521的鑒定

菌株AS3.521在PDA固體平皿培養基中培養生長較快，3天后可見成型菌落，對其進行觀察，見圖1。

如圖1所示，菌株呈圓形，直徑1.5 cm～3 cm，邊緣整齊，中間青綠色邊緣有少許白色，菌絲較為緊密，呈絨狀。菌落背面呈3個同心圓，中心黃褐色，外圈綠色，最外圈白色。結合《真菌鑒定手冊》，初步推測菌株AS3.521屬于青霉屬。

菌株AS3.521的ITS測定結果表明，擴增的序列全長550 bp。將測序得到的DNA序列進行檢索后選取菌株序列與AS3.521菌株序列建立系統發育樹，見圖2。

圖2 菌株AS3.521的系統發育樹Fig.2 The phylogenetic tree of strain AS3.521

如圖2所示，從系統發育樹中發現，菌株AS3.521與Penicillium chrysogenum位于同一分支，說明二者具有同源性，親緣關系最為接近。并且二者在Genbank中的相似值達99%。且結合《真菌鑒定手冊》的相關內容，將菌株AS3.521鑒定為產黃青霉。這和實驗室最初關于菌株AS3.521的記載相一致，說明菌株AS3.521在實驗室長期的菌種傳代保藏過程中未發生變種。

2.2 菌株AS3.521生長曲線的建立

每隔6小時/12小時對AS3.521菌株進行OD值的測定。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，得到AS3.521生長曲線，見圖3。

從生長曲線可以發現產黃青霉菌前6 h其生長極為緩慢，6 h之后生長速度加快，從6 h～42 h是其生長的對數時期，生長較為迅速，并在42 h達到生長最大值，42 h后進入平穩期，生長較為平穩。因此，我們選擇在42 h時加入底物根皮素，以使菌株AS3.521能夠充分轉化根皮素。

圖3 菌株AS3.521的生長曲線Fig.3 The growth curve of strain AS3.521

2.3 轉化產物的結構鑒定

累積得到的轉化產物按“1.3.5”項下操作，通過柱色譜分離后得到3個轉化產物：

化合物 1：白色粉末（甲醇），1H-NMR（400 MHz，in CD3OD），δ：7.02（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），2.8（2H，t，J=7.6 Hz，H-8），2.5（2H，t，J=7.6 Hz，H-7）；13C-NMR（400 MHz，MeOH），δ：180.1（C-9），155.3（C-4），131.5（C-1），128.7（C-2，6），114.7（C-3，5），35.8（C-8），29.8（C-7）。以上核磁數據與文獻[7]對照，鑒定化合物1為對羥基苯丙酸。

化合物 2：白色粉末（甲醇），1H-NMR（400 MHz，in CD3OD），δ：7.07（2H，d，J=8.3 Hz，H-2，6），6.70（2H，d，J=8.3 Hz，H-3，5）；13C-NMR（400 MHz，MeOH），δ：178.2（C-7），157.3（C-4），131.3（C-2 ，6），127.3（C-1），116.2（C-3 ，5），經過與文獻[8-9]數據比對，鑒定化合物2為對羥基苯甲酸。

圖4 轉化路徑的推測Fig.4 The speculation of conversation approach

化合物 3：白色粉末（甲醇），1H-NMR（400 MHz，in CD3OD），δ：7.85（2H，dd，J=6.8，1.9Hz，H-2，6），6.81（2H，dd，J=6.8，1.9 Hz H-3，5），3.83（3H，s，OCH3）；13C-NMR（400 MHz，MeOH），δ：178.3（C-7），132.7（C-2，6），116.3（C-3，5），52.2（OCH3），以上波譜數據和文獻[10]報道的茴香酸數據相一致，所以鑒定化合物3為茴香酸。

2.4 轉化路徑的推測

微生物代謝過程中會產生大量的酶，因此微生物發酵過程就是形成產酶系統的過程?；谖墨I，根據轉化產物的結構，推測該菌種代謝中的酶[11]主要有裂解酶和甲基化酶，見圖4。

如圖4所示，底物根皮素在裂合酶的作用下，C=O與C-1′鍵斷裂，并在P450氧化酶的作用下，得到產物對羥基苯丙酸。根皮素在裂合酶的作用下，C=O與其α碳連接鍵發生斷裂，C-2′和C-6′位發生去羥基化，得到對羥基苯甲酸，之后在甲基化酶的作用下，得到產物茴香酸。

通過對轉化路徑的推測可以發現，菌株AS3.521產黃青霉具有很強的裂解作用，并具有甲基化酶，可以對化合物進行裂解以及甲基化作用，在以后的化合物合成過程中加以擴大應用。根皮素轉化產物的液相分析見圖5。

圖5 根皮素轉化產物的液相分析Fig.5 HPLC analysis of biotransformation compounds from phloretin

3 結論

本試驗通過形態學觀察、ITS序列分析以及構建系統發育樹鑒定并鑒定了實驗室保存的AS3.521菌株確實為產黃青霉菌，說明菌株在傳代保藏過程中保存良好，未發生變種。本文詳細研究了該菌種對根皮素的轉化產物。首先利用測定OD值的方法建立了AS3.521產黃青霉菌的生長曲線，選取并確定了最優加入底物時間。通過定量給予培養基、孢子懸液，在28℃、160 r/min條件下培養后通過多種柱色譜結合的方法，共分離得到3個小分子裂解轉化產物，本文的研究結果為利用微生物的方法對根皮素進行生物合成奠定基礎。

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