靈芝孢子細胞壁降解菌的篩選及鑒定

楊杭，卓虹伊，練心潔，劉鳳，鄒亮，郭曉恒，雨田，*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理671000；2.成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137；3.成都大學藥學與生物工程學院，四川成都610106；4.成都大學醫學院（護理學院），四川成都610106）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱靈芝草、仙草、瑞草，是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌[1]。在2015年版《中國藥典》第一部中收入作為靈芝藥材來源的是赤芝（Ganoderma lucidum）或紫芝（Ganoderma sinense）的干燥子實體[2]。靈芝孢子為大型真菌植物靈芝在成熟時從菌蓋中彈射出來的極其微小的孢子[3]，其具有靈芝的全部遺傳活性物質，其藥用價值與藥理活性日益受到重視。靈芝多糖和三萜為其主要成分[4-5]，具有抗糖尿病的潛力[6]。其他藥理作用主要為抗癌[7]、免疫調節[8]、抗氧化[9]、神經保護[10]、保肝[11]等作用。

靈芝孢子具有雙層細胞壁，細胞壁主要為纖維素、幾丁質、木質素等，導致其細胞壁堅韌，不易破壞，有效成分溶出困難。因此，靈芝孢子破壁對于提高靈芝有效成分提取率和生物利用度具有重要意義[12-14]。近年來，破除靈芝孢子細胞壁的方法有5種，分別為生物法、化學法、物理法、機械法和綜合法[15]。其中生物法具有使用設備簡單、破碎效果較好、易于操作等優點[15]。生物法中的溶菌破壁法是利用生物自身的微生物或通過接種酵母、霉菌、乳酸菌等發酵，利用發酵過程產生的酶系水解細胞壁，使營養物質能釋放出來[16]。

產生纖維素酶、幾丁質酶的微生物分布廣，海洋、河流、土壤均為其理想分布場所。本研究從四川各地土壤中篩選微生物，對其進行鑒定，并以溶菌法作為破壁方法，同時測定靈芝孢子在發酵過程中多糖和三萜的含量變化，以期能較好的控制其發酵時間，提高靈芝多糖和三萜的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

幾丁質（批號：2014051001）、剛果紅（批號：2015060601）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號：20110219）：成都市科龍化工試劑廠；3.5-二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylic acid，簡稱 DNS試劑，批號：SDKJ20170401）：北京生東科技有限公司；細菌學蛋白胨（批號：3205082）、技術瓊脂粉（批號：3205079）、溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）培養基（批號：3105220）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，簡稱PDA培養基，批號：3105510）：廣州環凱微生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣：成都市科龍化工試劑廠；D（+）-無水葡萄糖（含量≥98% 批號：S08J6G1）、齊墩果酸（含量≥98% 批號：HA0820KA14）、N-乙酰氨基葡萄糖（含量≥98%批號：A07J7X17432）：上海源葉生物科技有限公司。

UV-7504單光束紫外-可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；CPA225D電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；DHG-9050B智能型電熱恒溫鼓風干燥箱：上?，槴\實驗設備有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；KH5200DE數控超聲波清洗器：昆山禾創超聲儀器有限公司；HC-3081R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；DHP-500型電熱恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器廠；ZHWY-100H恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；JJ-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；YM-50B立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司。

1.2 膠態幾丁質制備[17]

將5 g的粉末狀幾丁質溶解在88 mL濃鹽酸中，使溶液混合均勻后，在4℃下放24 h左右，一般邊攪拌邊過濾到200 mL蒸餾水中，用去離子水離心，反復多次洗至中性（pH=7.0）最后用蒸餾水定容至100 mL，將配置好的膠體幾丁質高壓滅菌后保存到4℃冰箱備用。

1.3 培養基

1.3.1 篩選培養基

真菌篩選培養基：KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、蛋白胨0.5%、膠態幾丁質1%～2%、瓊脂粉1.5%～2%、pH 7.0左右，121℃滅菌20 min。

細菌篩選培養基：K2HPO4·3H2O 0.4%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.14%、NaCl 0.1%、KCl 0.1%、CaCl20.02%、酵母粉 0.1%、膠態幾丁質1%～2%、瓊脂粉1.5%～2%、pH 7.0左右，121℃滅菌20 min。

1.3.2 發酵培養基

真菌發酵培養基：KH2PO40.1%、Na2HPO40.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、膠態幾丁質（或CMC-Na）1%～2%、瓊脂粉1.5%～2%、pH 7.0左右，121℃滅菌20 min。

細菌發酵培養基：K2HPO4·3H2O 0.4%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.07%、NaCl 0.05%、KCl 0.05%、膠態幾丁質（或CMC-Na）1%～2%、pH 7.0左右，121℃滅菌20 min。

1.3.3 種子培養基

PDA培養基：馬鈴薯 20%、蔗糖 2%、瓊脂粉1.5%～2%，蒸餾水1 000 mL，121℃條件下滅菌20 min。

LB培養基：蛋白胨1%、酵母膏0.5%、NaCl 1%、瓊脂2%，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.4 標準品的配置

葡萄糖標準品的配置：精密稱取24.33 mg的D（+）-無水葡萄糖標準品，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，得儲備液，4℃保存，備用；另精密吸取儲備液2.5 mL，用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，得標準品，4℃保存，備用。

齊墩果酸標準品的配置：精密稱取9.84 mg的齊墩果酸標準品，用95%乙醇定容至5 mL，搖勻，得儲備液，4℃保存，備用；另精密吸取儲備液2.5 mL，用95%乙醇定容至25 mL，搖勻，得標準品，4℃保存，備用。

N-乙酰氨基葡萄糖標準品的配置：精密稱取49.87 mg的N-乙酰氨基葡萄糖標準品，用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，得標準品，4℃保存，備用。

1.5 樣品采集

前往四川各地不同地區采集微生物土壤樣品，并記錄采樣時間，地點和土壤狀態等，見表1、圖1。

表1 采樣記錄表Table 1 Sampling record table

圖1 采樣地及樣品（部分）Fig.1 Sampling sites and sample（part）

1.6 微生物的分離與篩選

取10 g1.5中采集的土壤加入90 mL帶有小玻璃珠的無菌水中，充分振蕩后，用無菌水進行梯度稀釋。用移液槍分別吸取合適稀釋梯度的稀釋液0.5 mL，涂布于篩選培養基，真菌、細菌分別放置于28、37℃培養7 d，以能在膠態幾丁質平板上生長良好的菌株為篩選標準，挑取單菌落進行平板劃線分離純化，用種子培養基保存。

1.7 幾丁質降解率測定

將1.6中篩選得到的單菌落接種到富含膠態幾丁質的篩選培養基上，真菌、細菌分別放置于28、37℃恒溫培養箱中培養3 d，測量記錄菌落直徑H；然后用0.1%剛果紅溶液浸泡30 min，小心傾倒剛果紅溶液；再用1 mol/L的NaCl溶液浸泡30 min，小心傾倒NaCl溶液，可觀察到透明圈大小，測量記錄透明圈直徑C，計算C/H（透明圈直徑/菌落直徑）。C/H的比值越大，表明菌株對幾丁質的降解率越高；反之，越低。

1.8 纖維素酶和幾丁質酶活性的測定

1.8.1 葡萄糖標準曲線的繪制

取20 mL具塞刻度試管8支，分別加入D（+）-無水葡萄糖標準品溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，各以蒸餾水補至2 mL，充分搖勻后，向各試管中加入1.5 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。以蒸餾水作為空白對照，在540 nm波長下測定吸光度。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標，以吸光度值（A）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.8.2 N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線的繪制

分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL的N-乙酰氨基葡萄糖標準品溶液于9支比色管中，均用蒸餾水稀釋至1 mL，加DNS顯色劑1.5mL，在沸水浴中煮沸顯色10 min，冷卻，加蒸餾水補至10 mL，搖勻。以1 mL蒸餾水代替糖作空白管，在540 nm處測定吸光度。以N-乙酰氨基葡萄糖濃度（C）為橫坐標，以吸光度值（A）為縱坐標，繪制N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線。

1.8.3 酶活性的測定

用接種環從細菌斜面取菌體半環，用無菌水制成菌懸液，調節濃度為1×109CFU/mL；用接種環從真菌斜面取孢子半環，用無菌水制成抱子懸浮液，調節濃度為1×108個孢子/mL。吸取各菌懸液或孢子懸浮液1 mL接種于25 mL富含CMC-Na或膠態幾丁質的發酵培養基中，以接入1 mL無菌水作為空白對照。各重復3次，細菌和真菌分別置于37、28℃振蕩培養箱中培養，轉速為200 r/min培養，分別于48 h取出發酵液，9 000 r/min離心10 min取上清液定容至25 mL，待測。

纖維素酶活性的測定：取4支20 mL比色管，分別加入1 mL上清液，其中1支作為對照直接放入100℃水浴滅活10 min，取出后加入3 mL的0.5%CMC-Na，在放入50℃水浴30 min；另外3支加入3 mL的0.5%CMC-Na，放入50℃水浴30 min，然后4支一起放入100℃水浴滅活10 min，冷卻后12 000 r/min離心10 min，取上清液補至4 mL，加入3 mL DNS試劑，再沸水浴10 min，冷卻后加蒸餾水定容至20 mL，混勻，于550 nm處測定吸光度值（OD550）。

每一個成長階段的學生都會出現問題，需要教師的正確引導。每一個學生都是獨一無二的個體，教育沒有對錯，但是教育有成敗。適合學生的教育方式就是成功的教育方式。在日常班級管理中，就問題性質來分類教育學生。一方面，對于違反了原則性問題的學生，一定先嚴厲批評教育，當然要曉之以理、動之以情，再通過師生共同監督讓其改正。另一方面，對于非原則性的問題，要給予學生改正的機會和時間。此外，生生之間的榜樣示范作用，會比教師長篇大論地說教更有效。生生間的討論交流，同齡人的規勸，往往能直接激發學生內心向善改錯的動機。

幾丁質酶活性的測定：取4支1.5 mL離心管，分別加入上清液2mL，其中1支作為對照直接放入100℃水浴滅活10 min，取出后加入1 mL質量分數為1%的膠態幾丁質，在放入40℃水浴60 min；另外3支加入1 mL質量分數為1%的膠態幾丁質，放入40℃水浴60 min，然后4支一起放入100℃水浴滅活10 min，冷卻后12 000 r/min離心10 min，分別取上清液2 mL（空白對照為蒸餾水），加入已裝有1.5 mL DNS的試管中，100℃水浴10 min，取出后立即冷卻，補充蒸餾水至5 mL，震蕩放置20 min后于540 nm處測定吸光度值（OD540）。

1.9 菌種形態學鑒定

用顯微鏡觀察菌落在PDA（或LB）平板培養18 h～24 h后的菌落形態特征，24 h后進行革蘭氏染色，培養96 h進行芽孢染色；菌株LSX-9進行利用碳源產酸試驗、明膠液化試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、硝酸鹽還原試驗等生理生化試驗。

1.10 系統發育樹的構建

利用16 s和18 s rDNA通用引物對1.7中篩選得到的菌株進行PCR擴增和測序。經測序，菌株LSX-9的16S rDNA的部分序列長度為1 450 bp，菌株LSZ-1的18S rDNA的部分序列長度為1 362 bp，將二者分別上傳至 GenBank數據庫中，LSX-9的登錄號為MG283323，LSZ-1的 登錄 號 為 MG547960。 利 用BLAST程序在GenBank上對結果進行相似性比對，使用 MEGA7.0的鄰接（Neighbor-Joining，NJ）方法構建系統發育進化樹。

1.11 溶出曲線的繪制

1.11.1 多糖標準曲線的繪制

取9支具塞試管，分別加入D（+）-無水葡萄糖儲備液溶液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，各以水補至2.0 mL，然后加入新配置的5%的苯酚溶液0.6 mL，濃硫酸4.0 mL，搖勻，置于20℃的水浴鍋顯色20 min，而后立即置于事先準備好的冰水浴中冷卻10 min，以蒸餾水做空白，于491 nm處測定吸光度A。以 D（+）-無水葡萄糖濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制多糖標準曲線。

1.11.2 三萜標準曲線的繪制

取9支具塞試管，分別加入齊墩果酸標準品溶液0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL，各以95%乙醇補至1.0 mL，水浴揮干，放冷至室溫，加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液（顯色劑）0.25 mL，高氯酸0.6 mL，搖勻，置于70℃的水浴鍋中顯色15 min，而后立即置于事先準備好的冰水浴中冷卻10 min，取出，精密加入5 mL冰乙酸，以95%乙醇做空白，于546 nm處測定吸光度A。以齊墩果酸濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制三萜標準曲線。

1.11.3 釋放曲線的繪制

精密稱取0.1 g靈芝孢子粉，滅菌，分別加入0.5 mL LSX-9、LSZ-1的菌懸液，空白加入等量無菌水，然后分別將加有LSX-9和LSZ-1菌懸液的樣品置于37℃和28℃的搖床中，在48 h內每隔4 h取樣，取樣后分別加水或95%乙醇至1.5 mL，超聲10 min，10 000 r/min離心，取上清液，分別將多糖（水提?。┖腿疲?5%乙醇提?。┒ㄈ葜?0 mL和5 mL，待測。取多糖液0.25 mL，蒸餾水補至2 mL，用1.11.1項下方法測定多糖含量，繪制變化曲線；取三萜液0.25 mL。95%乙醇補至1 mL，用1.11.2項下方法測定三萜含量，繪制變化曲線。

1.12 數據處理

利 用 BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）分析工具，對菌株的16s和18s DNA序列與數據庫中已有的序列進行相似度比較分析；利用MEGA 7.0軟件進行DNA序列的校準排齊，并構建系統發育樹；數據均使用Excel 2016進行統計，Origin 9.1作圖。

2 結果與分析

2.1 幾丁質降解率

按1.7中方法測定菌株對幾丁質的降解率，其中以LSX-9和LSZ-1效果較好，其降解率如表2，剛果紅染色前、后效果如圖2。

表2 菌株的幾丁質降解率Table 2 Chitin degradation rate of strains

圖2 菌落圈與透明圈Fig.2 Colony circle and transparent circle

2.2 纖維素酶與幾丁質酶活性

2.2.1 葡萄糖與N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線

按1.8.1、1.8.2中方法，做出纖維素和幾丁質的還原性糖的標準曲線，如圖3，D（+）-無水葡萄糖的方程為 y=1.856 9x-0.006 3，R2=0.999 6；N-乙酰氨基葡萄糖的方程為 y=1.088 3x-0.002 0，R2=0.998 5。

圖3 葡萄糖與N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線Fig.3 The standard curve of glucose and N-acetylglucosamine

2.2.2 酶活性測定

按1.8.3中方法，測定出菌株LSX-9和LSZ-1的纖維素酶與幾丁質酶活性如表3。

表3 纖維素酶與幾丁質酶活性Table 3 Cellulase and chitinase activity

2.3 菌株形態學鑒定

LSX-9在PDA培養基上培養3 d，菌落呈裂葉狀，且有紅色素形成；在LB液體培養基中好氧（或厭氧）培養2 d，表面有菌膜產生，菌體呈桿狀，偶有細絲狀；G+；芽孢中生或端生；細胞呈單個或鏈狀排列。最適培養溫度37℃，pH 7.2～7.4，好氧，180 r/min。LSX-9的生理生化試驗結果如表4。

表4 LSX-9的生理生化試驗Table 4 Physiological and biochemical tests of LSX-9

圖4 菌株LSX-9的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain LSX-9

LSZ-1在PDA培養基上培養5 d，菌落中心凸起或平坦，少量呈輻射狀貼壁生長，有的菌絲為白色絨狀或絮狀，菌落反面黃褐色、淡黃色或帶綠的淡黃色；產大量分生孢子，中間多邊緣少，呈帶灰的橄欖綠或灰褐色，顯微鏡下能明顯觀察到到分生孢子囊，呈球形或半球形，成熟時呈致密的圓柱狀；在LB液體培養基中好氧培養2 d，菌體呈絮狀存在。最適培養溫度28 ℃，pH 7.2～7.4，好氧，180 r/min。

2.4 系統發育樹的構建

用MEGA7.0軟件，根據16s和18s rDNA序列相似性，將菌種LSX-9和LSZ-1與NCBI數據庫中相應的菌一起構建系統發育樹，見圖4、圖5。由系統發育樹可 知 ，LSX-9 為 Bacillus paralicheniformis，LSZ-1 為Penicillium sp.。

2.5 溶出曲線

2.5.1 多糖與三萜標準曲線

按1.11.1、1.11.2中方法，做出多糖和三萜的標準曲線，如圖6，多糖的方程為y=13.842 0x-0.011 5，R2=0.998 8；三萜的方程為 y=9.070 8x-0.006 5，R2=0.999 7。

2.5.2 多糖和三萜的釋放曲線

靈芝孢子在萌發時會消耗自身的營養物質，同時，再接入菌懸液后，菌在前期繁殖時會消耗纖維素、幾丁質等成分，促進多糖和三萜釋放，然后一部分多糖和三萜用于孢子的萌發，一部分被菌吸收進行二次繁殖。多糖和三萜的釋放曲線見圖7。

圖5 菌株LSZ-1的系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain LSZ-1

圖6 多糖與三萜標準曲線Fig.6 The standard curves of polysaccharides and triterpene

圖7 多糖和三萜釋放曲線Fig.7 The release curves of polysaccharides and triterpene

從圖7可以看出，在接入菌懸液后，靈芝孢子多糖和三萜的釋放時間有所提前，并且多糖和三萜的最大釋放量均較空白組（接入無菌水）高。在接入LSX-9菌種后，多糖溶出較空白組提前4 h，同時含量較空白組的23.44 mg/g升高到29.22 mg/g，提高了24.66%。在接入LSZ-1菌種后，多糖溶出較空白組無提前，但是含量較空白組升高到26.33 mg/g，提高了12.33%。在接入LSX-9和LSZ-1菌種后，三萜溶出較空白組提前20 h，三萜含量較空白組的6.29 mg/g分別升高到7.76 mg/g和6.92 mg/g，分別提高了23.37%和10.02%。說明在接入菌種后，菌種合成、分泌的纖維素酶、幾丁質酶能夠降解靈芝孢子的細胞壁的主要成分。

3 結論

本研究通過大量篩選工作，從土壤環境分別分離得到一株具有幾丁質酶、纖維素酶活性的細菌（LSX-9）和真菌（LSZ-1），并通過分子生物學鑒定其分別為Bacillus paralicheniformis和Penicillium sp.。對菌懸液與靈芝孢子的初步作用進行了研究，結果表明，LSX-9和LSZ-1能縮短多糖與三萜的釋放時間，并能提高多糖與三萜的提取率，表明菌株對靈芝孢子細胞壁有一定的降解作用，對靈芝孢子生物破壁法的研究有一定的參考意義。Bacillus paralicheniformis是Bacillus licheniformis的特異菌株，具有很大的相似性[18]，是芽孢桿菌中應用較廣泛的有益菌種之一，具有刺激動物免疫器官的生長發育，增強細胞與體液免疫的功能[19]，同時Bacillus licheniformis進入動物腸道后能夠抑制大腸桿菌等有害菌的繁殖，并促進雙歧桿菌等有益菌的增殖，提高動物免疫力，提高飼料消化率，促進動物生長，改善飼養環境[20]；青霉屬真菌已被證明可產生包括青霉素和灰黃霉素等在內的多種重要活性代謝產物以及纖維素酶、蛋白酶和脂肪酶等具有應用前景的酶類，因而被廣泛應用于藥物的研制、工業原材料的制備、新型酶制劑的篩選以及食品加工業等領域。近年來，有研究顯示，青霉屬真菌還具有降解多種環境有害物質（如芳烴類化合物等）的能力，在環境污染治理領域顯示出良好的開發應用前景。表明Bacillus licheniformis和Penicillium sp.均不會對人體產生有害的影響。同時高等植物和真菌細胞壁結構組成、化學成分相似，暗示其可以在中藥微量成分上具有較大應用前景。

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