凍藏過程中冰晶對水產品品質影響的研究現狀

向迎春，吳丹，黃佳奇，余海霞，楊水兵，胡亞芹，，*

（1.浙江大學食品與營養系，浙江省農產品加工技術研究重點實驗室，浙江杭州310058；2.杭州知味觀食品有限公司，浙江杭州311115；3.浙江大學舟山海洋研究中心，浙江舟山316021）

水產品因其高蛋白質、低脂肪的“白肉”特性，我國營養學會將其列入“中國居民膳食指南”，推薦人均每天攝入50 g～100 g，作為平衡營養，獲取優質蛋白質的重要來源[1]。但水產品特殊的肌肉組分及生存條件，使其捕撈后比一般畜禽肉組織更易受到微生物污染，也更加容易腐敗變質。因此人們極大地依賴于保鮮技術來貯運新鮮水產品。低溫冷凍保藏作為目前為止水產品貯藏中最廣泛應用的保鮮方式，能夠較好地保持水產品的營養價值、風味并延長其貨架期，極大地提高了水產養殖業的經濟效益[2]。

凍藏過程中，低溫可以抑制水產品肌肉組織中的酶活性及微生物的生長。但低于冰點的溫度引起肌肉組織水分結冰，形成的冰晶破壞其細胞結構，使凍品組織、色澤、風味、營養等發生一系列變化，最終引起冷凍水產品品質的降低。加之目前冷鏈技術的缺陷，在實際捕撈運輸、貯藏及銷售過程中，溫度的波動極易引起凍品發生反復凍融現象。在此過程中，冰晶的形成、融化以及重結晶使組織內小冰晶依附于大冰晶，引起冰晶數量的減少及個體體積的增大，從而造成細胞結構的破壞，并最終加速一系列理化感官品質的下降[2]。

近年來，低溫凍結及貯藏過程中冰晶的形成長大對凍品肌肉組織的影響不斷受到國內外學者的關注[3-4]。因此，本文旨在整理前人的研究，綜述凍藏過程中冰晶的成核、長大以及此過程中水產品的一些理化性質的基本變化，其中包括冰晶在凍藏過程中的整個變化過程以及凍藏過程中組織營養、感官品質的變化，進而總結出冰晶形成對肌肉品質的影響?？蔀榭刂扑a品在凍藏過程中不同時期冰晶的形成及生長情況，提高凍藏水產品品質、延長貨架期提供理論依據。

1 冰晶在凍藏過程中的生長特點

在凍藏過程中，冰晶的產生及生成量是衡量水產品品質的一個非常重要的參數。其中，冰晶的形成分為成核及晶體長大兩步，同時溫度波動也伴隨著重結晶現象的發生[5]。冰晶在形成過程中的成核、長大以及重結晶一定程度地影響著產品的最終品質。因此，了解冰晶在凍藏過程中的生長特點，闡明機制并對其實施相應的控制措施將極大地促進凍藏水產品品質的提高。

1.1 冰晶的生成

冰晶形成的初始階段是晶核的形成，晶核一旦形成，冰晶在結晶驅動力的作用下就會快速生長。這種驅動力促使晶核吸附周圍的水或水蒸氣形成冰晶并不斷長大。這是由于凍結后的水產品組織中存在固態的冰晶、液態的水溶液及氣態的水蒸氣3種不同形態，使組織內產生水蒸氣壓差，水蒸氣從高向低流動以達到氣壓平衡，最終凝結到氣壓最低的大冰晶上[6-7]。在冰晶長大的過程中，固態冰晶的形成使肌肉組織細胞比表面積增大，造成細胞損害，從而引起組織內一系列生化反應的發生。最終引起水產品營養價值及食用風味的下降[8]。

水產品作為一個大的空間組織體，由無數細胞組成。闡明凍品中冰晶生成與細胞破壞之間的關系是提高凍品品質的關鍵，關于組織冷凍過程中胞內冰晶形成先發生還是細胞損傷先發生一直是研究者爭論的話題。Mazur[9]和Toner等[10]認為胞內冰晶形成是導致細胞損傷的主要原因。胞內冰晶形成使胞內液體變成固體，化學勢能的變化使胞內體積膨脹引起細胞損傷。Mazur表示產生于細胞外部的晶核，透過細胞膜上的微孔，細小的晶核向胞內生長引起胞內結晶。這是深受廣大學者支持與應用的“孔理論”學說[11]。Toner等表示冰晶形成分胞內和胞外，胞內指在低溫凍結時細胞內一些微小的物質直接促使胞內水分結晶；胞外指受細胞外部低溫的影響，細胞外的溶液先達到凍結點開始成核結晶，胞外冰晶由于化學能的作用間接引起胞內結晶。而Muldrew等[12]的理論則認為細胞損傷先于胞內結晶，胞外先形成冰晶，在低溫下胞外冰晶擠壓細胞膜，使細胞膜受到機械壓力和化學作用而損傷，從而使胞外冰晶直接通過破壞的細胞膜向胞內生長引起胞內結晶。

1.2 冰晶的重結晶

冰晶對溫度的波動十分敏感。在冰晶形成中及形成后，周圍環境的細小變化都極易引起數量、大小及形狀的變化而產生重結晶現象。在水產品凍藏過程中，受熱動力學效應影響，組織內水分子由小冰晶變成大冰晶，冰晶數量減少，表面能降低，從而發生重結晶[13]。另外貯藏溫度發生波動時，溫度在升溫又降溫過程中小冰晶變小、消失，大冰晶繼續長大，這個過程對肌肉細胞又一次產生機械損傷。在恒溫時組織中一些水蒸氣從高蒸汽壓區域向低蒸氣壓區域轉移，冰晶產生重結晶對組織造成再次破壞[14-15]。

因此在凍藏過程中有目的地抑制晶核的形成、促進冰晶的快速生長或者避免冰晶的重結晶都能更好地延緩凍品品質的劣變。

2 冰晶對水產品品質的影響

在低溫冷凍保藏過程中，水產品隨著貯藏溫度的下降及貯藏時間的延長，肌肉組織通過最大冰晶生成帶，水分相繼凍結。其中肌體內的蛋白質、脂肪、組織液、質構、色澤以及微生物數量等一系列指標發生相應變化[16]，最終影響水產品的口感及風味，降低其營養與經濟價值。冰晶是影響此過程品質變化的關鍵因素。冰晶形成的時間、大小、形態以及分布均與凍藏中的組織變化密切相關，從而影響著產品的營養與感官品質[17]。

2.1 冰晶對營養品質的影響

2.1.1 冰晶對蛋白質的影響

動物性水產品的蛋白質含量僅次于組織內水分含量，它參與構成生物體及完成肌體生命活動，從而影響著水產品肌肉組織的形態及品質變化。在肌肉蛋白質中，鹽溶性的肌原纖維蛋白含量最高，占蛋白總量的65%～75%[2]。研究者常常根據肌原纖維蛋白的變化來評價蛋白質的變性程度。在水產品的凍藏過程中，蛋白質變性引起肌原纖維蛋白結構特性及功能性質的降低，從而使影響著產品的口感、風味、營養及商用價值。凍藏中的肌肉組織蛋白質變性，很大程度上取決于組織中冰晶生成對其的影響。凍藏過程中形成大小不同的冰晶均對細胞膜及細胞的組織結構產生破壞，進而加速蛋白質的變性[18-19]。

關于蛋白質的冷凍變性目前尚無定論，主要有“細胞液濃縮學說”、“結合水分離學說”及“冰晶破壞作用學說”3種假說。

“細胞液濃縮學說”基于水分結冰而使細胞液濃度升高提出。在凍藏條件下，組織中的自由水與結合水相繼凍結，導致細胞液的離子濃度升高，離子強度及pH值改變，促使部分物理化學性質的變化以及冰晶破壞細胞內外的組織結構，蛋白質分子最終發生不可逆的改變[20]。Kaale等[21]研究發現，大西洋鮭魚在第3天組織內冰晶達到最大值，其后冰晶變化不大，而鹽溶性蛋白在微凍第7天到第14天下降明顯，說明冰晶間接影響著品質變化。

“結合水分離學說”認為水產品在凍藏初期，組織內自由水先于結合水結冰，隨著凍藏時間的延長，未凍結的水分子在驅動力作用下向晶體聚攏，冰晶不斷長大，大量結合水分子的減少最終使游離出來的功能基團相互作用發生聚集變性。特別是在慢速凍結過程中，形成的冰晶影響水分子的正常分布，解凍后的結合水與自由水不能回到最初位點，復水力下降導致蛋白質變性加劇[22]。圖1[23]為蛋白質聚集變性模型。

圖1 蛋白質冷凍凝聚變性模型Fig.1 Model of protein denaturation of freezing aggregation

此模型充分描述了此學說的變性過程。螺旋結構的蛋白質在一定低溫下，部分水分子開始結晶。蛋白質分子中的側鏈在冰晶的擠壓下發生聚集，蛋白質周圍的游離水分子因重新排布而失去復水力，從而導致蛋白質變性[22]。汪秋寬等[24]研究發現，經過凍藏的鯉魚鹽溶性蛋白減少，經過SDS-PAGE采用電子顯微鏡觀察發現凍藏過程中鯉肌肉纖維出現裂縫和間隙，肌原纖維蛋白空間結構發生改變，說明在鯉魚凍藏過程中組織冰晶增大而使肌原纖維蛋白的脫水變性。

“冰晶破壞作用學說”則認為冰晶的形成改變了結合水與蛋白質的結合狀態，使蛋白質內部鍵展開，重新生成二硫鍵、氫鍵、離子鍵等一些新鍵，蛋白質分子內部構造改變，從而使蛋白質變性[25]。圖2為非螺旋結構或球形結構的蛋白質在凍藏中的展開變性[23，26]。

圖2 蛋白質開鏈變性模型Fig.2 Model of protein denaturation of unfolding

未凍結時，部分蛋白質分子以高度水化的折疊狀存在，非極性基團相互作用形成非極性鍵，因為位于分子內部而避開與水分子的接觸，所以狀態比較穩定。低溫凍結時，冰晶的形成使蛋白質水化程度降低，蛋白質分子展開變性。此學說較好地結合了蛋白質結構與價鍵變化的關系，常被學者用來研究細胞內外冰晶生長狀態及生成量與蛋白質變性間的關系，在冷凍變性解釋中運用最為廣泛。袁麗等[27]用拉曼光譜技術分析凡納濱對蝦肌肉蛋白質在不同凍藏溫度下的二級結構，表明冰晶形成使蛋白質結構改變，暴露出的活性巰基被氧化成二硫鍵，使結果中巰基含量減少而二硫鍵含量增加；而且發現凍藏溫度越高蛋白質結構松散越明顯。Benjakul等研究發現在凍藏過程中，軟殼蟹其總巰基含量大幅下降。其在石首魚、鲅鳊魚研究中也得到相似結論[28]。姜晴晴等[29]的研究表示隨著凍融循環次數增加，蛋白羰基含量顯著增加而巰基含量顯著下降，這可能與反復凍融冰晶不斷長大對組織的破壞程度有關。

以上冷凍變性學說很好地解釋了冰晶形成對蛋白質的影響?？倸w可以解釋為：凍藏過程中冰晶的生成影響著蛋白質結構特性的改變，其中主要引起肌原纖維蛋白結構特性的變化，進而引起功能特性的改變及品質下降。形成的冰晶擠壓并刺破細胞導致胞內的酶外泄流失引起酶活性的降低。水分子凝結成冰引起離子濃度升高及加速生化反應的發生，使肌原纖維蛋白含量下降。蛋白質變性最終表現為肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性減弱、鹽溶性含量減少、總巰基含量降低及二硫鍵含量增加等[21，27，30-34]。Benjakul等[28，35]研究發現在凍藏過程中，黃花魚、蜥魚、軟殼蟹等的Ca2+-ATPase活性隨凍藏時間延長而降低。郭園園等[36]在對鰱魚的研究中也得出了相似結論。Wu等[37]在不同溫度下凍藏大頭鯉魚，溫度越低其鹽溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性和總巰基含量越高，說明凍結時溫度越低，形成冰晶越細小均勻，蛋白質的變性程度越小。這些明顯的蛋白質變化都是由冰晶直接作用引起，從而間接影響著水產品品質[18]。林婉玲等[38]研究表示浸汁凍結速度快，形成的小冰晶對組織損傷小，肌球蛋白中暴露的疏水基團相對少，Ca2+-ATPase活性及巰基氧化程度都相對較小，因此蛋白質變性程度低，冷凍草魚的品質更好。魯耀彬等[26]研究表示鹽溶性蛋白中結合水結冰導致蛋白析出，促進疏水鍵和氫鍵的形成引起蛋白變性。為了減輕冰晶對蛋白質的影響，大量研究者采用抗凍劑來抑制冰晶對蛋白質的破壞。Badii等[39]在凍藏鱈魚片時添加蔗糖及山梨醇抗凍劑比直接凍藏鱈魚片蛋白質提取率高，說明抗凍劑可以減少冰晶的生成，延緩蛋白質變化。馬璐凱等[31]通過添加海藻糖等抗凍劑抑制了蝦仁組織內冰晶對其的機械破壞，從而防止了肌球蛋白重鏈發生變性。

2.1.2 冰晶對脂肪的影響

大多數水產品富含高不飽和脂肪酸，機體極易受脂肪氧化引起品質劣變。水產品在凍藏過程中冰晶形成對脂肪氧化的影響不容忽視，脂肪的氧化間接地改變魚體的水合性、組織結構、顏色及風味等一系列營養品質。水產品在凍藏過程中，低溫使大部分水分凍結成冰從而抑制組織活性，但部分未凍結水仍然會引起一系列生物化學反應的發生[40]，脂肪氧化就是其中極易發生的一種。研究表明，在凍藏溫度高于-20℃時，組織中有部分未凍結水，這很可能是引起脂肪氧化的重要原因[41]。而且組織中的水分結晶引起細胞內外的溶液濃度升高，從而增加了凍藏過程中未凍結溶液的反應。其次，冰晶對肌體細胞膜及細胞器造成機械損傷，其中的血紅素鐵等一些促氧化物質得以釋放，引起脂肪的氧化[42-43]。在超低溫條件下，組織表面冰晶升華留下微小的孔洞，增大了組織內部與氧氣的接觸面積，從而引起組織脂肪酸敗及羰氨反應的發生。另外，組織中的脂肪酸還會由于冰晶的壓力作用從內部轉移到表層，使其很容易與空氣中的氧氣發生作用而腐敗。脂肪氧化又往往同蛋白質的分解產物如氨基酸、鹽基氮以及冷庫中的氨共存從而造成水產品的色香味嚴重變化。凍融過程冰晶破壞細胞使一些抗氧化酶類流失，也會使脂肪氧化。

在水產品中，硫代巴比妥酸值（TBA）常被人們用來評價脂肪氧化的程度。Hong等[44]對大頭鯉魚進行不同方式凍藏保鮮，其中凍藏溫度越低，溫度波動越小，冰晶體形成越小，相應TBA值最小。但是一直-18℃貯藏比先-40℃再-18℃儲藏TBA值增長較大，這應該與凍結速率引起的冰晶大小有密切關系。Sarkardei對竹莢魚的研究也有類似結果[45]。Burgaard等對虹鱒魚在不同溫度凍藏條件下的肌肉品質測定表明，-10℃和-20℃的慢速凍結條件下，脂肪酶的釋放引起脂肪氧化，這可能是慢速凍結形成的大冰晶對細胞的破壞導致溶酶體析出所致[46]。鄭振霄等[47]用海水預冷24 h再凍藏，TBA值明顯低于直接凍藏和直接海水保鮮，因為海水預冷再凍藏有效縮短了溫度通過最大冰晶生成帶的時間，而且海水預冷使魚體表面形成一層冰衣也抑制了脂肪的氧化[48]。姜晴晴等研究表示反復凍融過程中的結晶與重結晶生成的大冰晶對組織損傷引起一些氧化酶汁液的流失，大大增加了脂肪氧化幾率[29]。

2.1.3 冰晶對水分的影響

水分含量是評價水產品新鮮度的一個重要特征，是水產品維持其活體狀態的最基本指標。凍藏改變了組織中水分的分布及含量，從而引起組織結構改變以及一些生化反應的發生。在水產品的凍藏過程中，液態水的減少是冰晶形成最直觀的表現。其次水產品凍結中的冰晶從固態變成氣態，水產品組織內水分子減少，組織表面水分發生干耗使組織重量減輕、組織表面失去透明感以及組織變得干柴，從而引起凍品品質下降[49]。

對于肌肉組織水分含量的評定，人們常用液滴損失、蒸煮損失率及持水性等指標來評定[50]。冰晶形成和生長對組織細胞結構的機械損傷，使細胞破裂以及組織間隙增大，造成凍結水產品解凍后汁液流失，持水性下降。凍藏中汁液損失很大程度上取決于凍結速率以及凍藏溫度，凍結速度越快，冰晶形成越細小均勻，相對緩慢凍結造成的液滴損失較小。Maria[46]等對虹鱒魚用不同凍結速率進行凍結，凍結速率越快，鱒魚液滴損失越小持水性越強，分別在不同溫度下進行保藏發現，-10℃和-20℃比其它更低溫度的液滴損失大。此結果與其對鱈魚相同處理條件下結果一致[5]。Hu等[51]研究表明冰箱直接凍結相比液氮凍結速度慢，形成的冰晶大，導致持水性低于液氮凍結。Rodezno等[52]對鯰魚進行快速低溫凍結和慢速鼓風凍結發現，快速低溫能使鯰魚更快通過最大冰晶生成帶，水分流失相對鼓風凍結流失小。此結果與Boonsumrej[53]和Campa?one等[54]的報道結果相似，即慢速凍結形成更大冰晶，損壞細胞導致水分流失更多。郝淑賢等[55]研究表示快速凍結能使組織更快通過最大冰晶生成帶，形成的冰晶小，細胞破壞相對更小，所以-80℃的快速凍結比-18℃的慢速凍結液滴損失小。但是，目前國內外的研究對于水分損失率尚沒有一個通用標準，研究者由于不同的目的使用不同的方法，從而很難直觀地從文獻中得出統一結論。

張強等[56]測量不同溫度條件下凍藏的凡納冰對蝦解凍損失率，發現前15天，-5℃微凍蝦的液滴損失率最小，組織形成冰晶較少，而-18℃凍結形成冰晶最大，液滴損失率最大，-35℃和-60℃次之。而15天后-5℃損失率高于-60℃，可能是隨著貯藏時間延長，微凍蝦也有大量大冰晶形成破壞組織。Xia等[57]研究認為水產品解凍時的汁液流失與組織在凍藏中冰晶長大及凍融過程中重結晶所受到的機械損傷有關。凍品解凍過程中蛋白質、脂肪和礦物質等隨著凍品汁液的流失而減少，造成水產品營養品質的下降。袁麗等[27]研究認為，凍藏溫度越高，表層結合水與蛋白質的作用越弱，導致蛋白質周圍水分流失更嚴重。

2.2 冰晶對感官品質的影響

2.2.1 冰晶對色澤的影響

色澤是消費者對水產品進行評價的最直觀的指標，色澤好壞直接影響消費者的購買欲。冰晶引起的組織破壞以及凍結過程中肌紅蛋白的氧化、脂肪的氧化、水分的蒸發等理化性質的變化都影響著色澤的改變[58]。冰晶的形成引起組織液溶度的升高，色澤也因此加深。

人們常采用L*代表黑白色度，a*代表紅綠色度，b*代表黃藍色度來綜合評價食品中的色澤變化。張強等對凡納冰對蝦在不同溫度下凍藏表明-35℃和-60℃的快速凍結色差與亮度值相對于-5℃的慢速凍結變化小，這可能與冰晶對蝦肌體的損傷程度有關。Thanonkaew等[58]研究表示色澤變化不僅與冰晶引起的汁液流失有關，而且與冰晶引起的一系列理化變化有關，脂質的氧化、蛋白質的變性都極大地影響著色澤的變化。姜晴晴等[56]研究反復凍融的帶魚表示，隨著凍融次數的增加，脂肪氧化及蛋白變性更嚴重，伴隨著色澤逐漸消失，肌肉切面變暗淡。史策等[59]對鰱魚反復凍融后，冰晶對組織的破壞使魚肉的L*值和b*值均逐漸增大，色澤發生劣變，肉的可接受程度降低。郝淑賢等[55]研究表示-80℃凍結組比-18℃凍結組蝦仁溶解后的L*值更低，可能是因為-18℃冰晶形成更大，導致持水性下降，溶解后組織表面游離水增加，對光的反射性增強引起L*值更高。馬璐凱等[31]用海藻糖、海藻膠寡糖及焦磷酸鈉處理蝦仁比沒有抗凍劑處理后凍結，明度L*明顯減小，這表明處理后蝦仁內的冰晶對組織損傷較小，抗凍劑有抑制冰晶破壞細胞的作用。

2.2.2 冰晶對質構的影響

質構作為消費者最直觀的品質感受，常被研究者作為水產品品質評價的重要指標[60]。水產品組織隨著凍融過程發生相應變化，凍藏中冰晶的形成重結晶是影響其變化的主要因素。冰晶形成使組織液態水減少，組織比表面積增大對組織細胞造成機械損傷，細胞間隙增大，從而使肉質失去彈性，組織軟塌[29，57-58]。在凍結過程中，水產品因為組織水分轉化為冰，質地變硬。其中的硬度與凍結水量的多少相關，組織在結晶變硬后剪切力變大、嫩度降低、口感變差[61]。

人們一般采用硬度、彈性、脆性、剪切力等的變化大小來評價質構的變化。張強等[56]對凍藏凡納濱對蝦研究表明凍藏溫度越高，硬度增加越大，咀嚼性及彈性下降越明顯。姜晴晴等[56]對帶魚的凍融研究中發現隨著凍融次數增加，冰晶重結晶現象越嚴重，硬度、咀嚼性、彈性都下降明顯。Hu等[51]通過電鏡觀察不同凍結條件下帶魚微觀組織結構，發現液氮速凍肌肉橫切面更光滑平整，這可能是更快凍結速率下肌肉組織冰晶越小，對細胞的破壞程度越小。Badii等[39]在凍藏鱈魚片時添加蔗糖及山梨醇抗凍劑比直接凍藏鱈魚片210天后肉質更柔軟。說明抗凍劑可以減少冰晶的生成，延緩質地變硬。

3 結論

冷凍保藏延長了水產品的貨架期，較好地保持了水產品的營養價值及風味。但與此同時，凍藏過程中冰晶的形成對水產品肌肉組織的損害影響著水產品的品質。因此，提高凍結速率及改善凍結過程以減小冰晶的大小及生成量，減少冰晶對組織的損害是提高凍品品質極其有效的方法。目前人們嘗試使用抗凍劑、抗氧化劑等生物保鮮劑輔助凍結，高壓電場、超聲等機械設備輔助凍結，減小最大冰晶生成帶的生成時間，對水產品凍藏保鮮起到了一定成效。尚需通過進一步闡明冰晶形成機理與水產品品質變化間的關系，有目的地抑制冰晶的形成來提高凍藏水產品品質，進一步增加日漸衰竭的水產資源的有效利用率。

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