膠原蛋白發展進程中的3個問題

吳琎，徐雨情，王永久，段蕊

（淮海工學院海洋生命與水產學院，江蘇連云港222005）

膠原蛋白指的是生物體內細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的一類結構蛋白質，是一類外觀呈白色、不透明、沒有支鏈的纖維型蛋白質，它一般分布于動物肌腱、韌帶與軟骨、皮膚以及一些結締組織中，是現今哺乳動物各組織器官中含量最為豐富、覆蓋面積最大的一種蛋白質，其分子中通常最少有1個由α鏈構成的三股螺旋構象的結構域，生物學上也稱膠原域，是高度保守的特征性結構。膠原蛋白在生物體內作為一種重要的功能性蛋白質，在細胞再生、保證皮膚、骨骼發揮正常功能中發揮重要作用，同時也與動物的細胞分化、細胞衰老、關節潤滑及疾病產生息息相關[1]。

膠原蛋白產品的研發使用開始于日本，起初有關這一新興產品功效的爭議不斷，這引起了日本各界的廣泛關注，由此也推進了大量科研成果的產生。從備受質疑到被少數人接受直至被消費者廣泛認可，膠原蛋白已經成為日本人民日常使用的食品添加劑，在食品領域得到了廣泛的應用[2]。就全球領域而言，膠原蛋白早已不再單一應用于食品行業，它被廣泛使用于于醫療藥品、化妝品及包裝材料等各領域[3]。我國從2005年開始興起了一股膠原蛋白熱潮，目前的膠原蛋白產品市場年需求量已經達到了15 300 t，發展速度與規模與日俱增，但在消費者及科研人員中仍存在著較大的爭議。這主要由于中國膠原蛋白行業起步較晚，市場教育不到位，行業統一標準尚未制定等原因所致。同時，國內的眾多消費者在對膠原蛋白的認知與消費理念上還與日美各國存在著一定的差距，這些綜合問題導致了中國的膠原蛋白行業發展存在著各類不規范現象，使得膠原蛋白產業整體發展相對緩慢。

1 產品稱謂界定

膠原蛋白產業的發展中有一些問題需要明確，首先是膠原蛋白的定義與界定[4]。膠原蛋白是一類物質，其結構有相似之處，但應用領域不同，其具體定義并不完全相同，目前市場上的膠原蛋白主要有兩類產品。

第一類，應用于生物學及醫學領域，此類膠原蛋白產品一般是指從生物體中提取得到的具有完整三螺旋結構和能很好發揮細胞間質功能的產品（不變性膠原蛋白產品）[5]，此類產品目前應用于醫療器械、細胞培養等領域，應用者多為生物領域專業人員。第二類產品是在食品、保健品、化妝品等領域的膠原蛋白，此類產品是以動物皮膚、骨骼等為原料，經提取、酶解等工藝制備的小分子肽類產品[6]。此類產品是隨現代酶制劑工業的發展而發展起來的，目前廣泛用于食品配料、口服液、面膜、保健食品中，與消費者聯系最為密切，也是廣受詬病的膠原蛋白制品，目前關于膠原蛋白的負面報道均來自于此類膠原蛋白產品，應用者多為普通民眾。

由于膠原蛋白在不同領域代表了不同的產品，因此在稱謂使用過程中應該注意區分。特別是政府部門在標準制定以及行業協會在產品名稱使用方面要區分開來。如目前我國比較普遍采用的膠原蛋白產品標準分別有：QB 2732－2005《水解膠原蛋白》、GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》、SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》，還有一些企業標準如Q/JYB 0065 S-2010《復配膠原蛋白粉》。

就 QB 2732－2005《水解膠原蛋白》和 SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》而言，在其名稱上均可以明確的看出其產品標準是針對以富含膠原蛋白的動物皮膚、骨骼及明膠等為原料，經提取、酶解等工藝制備的肽類產品。GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》也同樣聲明了其產品為肽類制品。以上標準在使用上較好的避免了兩類膠原蛋白產品的混淆。

但是一些企業標準如Q/JYB 0065 S-2010《復配膠原蛋白粉》，則可能產生歧義。從稱謂上看，容易被誤認為其產品為生物學意義的膠原蛋白，但從內容上看其主要是膠原蛋白肽。

建議如果產品生產工藝過程中有超過50℃的保溫以及酶解工藝，其產品在名稱上需要冠以“膠原蛋白肽”稱謂，明確其產品本身是“肽類制品”?！八饽z原蛋白”雖然與“膠原蛋白肽”為同一類產品，但水解是工藝過程，得到的產品則是肽，因此“膠原蛋白肽”的稱謂則更能體現產品的本質。

同時也建議從事膠原蛋白產品研究與銷售的行業協會及科研團體在以后的研討、產品研發、質量檢測等活動中，盡量區分“膠原蛋白”與“膠原蛋白肽”[7]，使產品的稱謂符合其本身科學的定義。

2 膠原蛋白測定

目前，膠原蛋白并沒有特異性的檢測方法，國標中膠原蛋白總量的檢測一般采用凱氏定氮法[8]，在實際生產或研究開發過程中還可以采用雙縮脲法、紫外檢測法、Lorry法等[9-12]，但無論采取哪種方法，所測定的值都代表了樣品中總蛋白的含量或肽鍵的含量，而不只是膠原蛋白的含量。

雖然我國涉及膠原蛋白的幾個標準中，目前大部分仍在使用凱氏定氮法對膠原蛋白進行檢測[13]，但應該注意其凱氏定氮換算系數與一般蛋白質不同。

對幾種不同來源膠原蛋白的氨基酸組分進行分析，確定其占總氨基酸中的數目，并計算N元素的含量，得到的凱氏定氮換算系數如表1。

表1 幾種來源不同的膠原蛋白及肽類制品的氨基酸組分及N元素含量Table 1 Amino acid and N composition of collagen from various collagen byproducts

續表1 幾種來源不同的膠原蛋白及肽類制品的氨基酸組分及N元素含量Continue table 1 Amino acid and N composition of collagen from various collagen byproducts

從來源不同的膠原蛋白及肽類制品氨基酸組分及N元素含量的分析表中可以看出[14-15]，由于膠原蛋白的特殊氨基酸組成導致其中甘氨酸的含量約占總氨基酸含量的三分之一左右，所以N元素的含量比一般的牛奶、雞蛋蛋白的（16%）含量要高，如阿拉斯加鱈魚膠原蛋白中N元素含量為18.7%，折算后凱氏定氮的系數只有5.35，牛皮膠原蛋白中N元素含量為17.54%，折算的凱氏定氮系數為5.70，因此國家標準中膠原蛋白及肽類制品中蛋白質檢測項目中，凱氏定氮法折算常數是5.79，而不是一般的6.25。

由于羥基脯氨酸是膠原蛋白中特異性的氨基酸，在其他蛋白中不存在或很少存在，所以采用測定羥基脯氨酸含量的方法來比較產品中膠原蛋白的有效含量更為可靠。羥基脯氨酸含量的測定一般采用比色法，具體步驟可以參照GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》[16]。由于羥基脯氨酸含量測定過程中的影響因素[17]較多，在實驗過程中應嚴格控制顯色及測定的溫度和時間。此方法測定過程中不需要昂貴的儀器和設備，方法適用性強。

就不同原料得到的膠原蛋白產品中羥脯氨酸含量而言，最低的是深海魚膠原蛋白或肽類制品。即當產品中羥脯氨酸含量相同的情況下，深海魚制品中膠原蛋白或肽類的有效含量最高，這也是當前大部分膠原蛋白聲明其產品來源于深海魚的原因之一[18]。由表1可以看出，對于牛皮或豬皮膠原蛋白來說，每1 000個氨基酸殘基中，羥脯氨酸含量分別為94和91個，而對于大西洋鱈魚和阿拉斯加鱈魚來講，分別為51和55個，折算成質量分數后，羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）的最高含量約11.57（牛皮），最低含量最低約為6.12%（大西洋鱈魚）。在GB/T 22729－2008[19]《海洋魚低聚肽粉》中，海洋魚皮低聚肽粉中羥脯氨酸含量的限定≥3%，海洋魚骨低聚肽粉中羥脯氨酸含量≥2%，標準相對偏低；而商業部中SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》中羥脯氨酸含量限定≥5.5%的標準，經過計算比較合適。為了保證測定樣品中羥基脯氨酸來源于膠原蛋白或其肽類制品，還有必要測定樣品中游離羥基脯氨酸占總羥基脯氨酸的比例，目前只有國家商務部發布的“淡水魚膠原蛋白肽粉國內貿易行業標準 SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》[20]”中，對此項指標進行了明確的規定，即游離羥基脯氨酸與總羥脯氨酸的質量比≤5%。

另外由于膠原蛋白特殊的結構[21]，甘氨酸殘基的量是所有氨基酸中含量最多的，約占總氨基酸殘基數量的33%，折算成質量分數，其含量不小于總量的18%。但是目前我國的膠原蛋白及肽類制品標準中尚沒有甘氨酸以及L-脯氨酸、丙氨酸的限定指標。在2010版國家藥典中規定，阿膠中L-羥脯氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、丙氨酸這4種氨基酸的含量分別不得少于8.0%、18.0%、10.0%、7.0%。由于阿膠的原料是驢皮，其氨基酸組分相對穩定，所以檢測標準較為容易確定。市售的膠原蛋白及肽類制品原料來源雖然復雜，但也可借鑒藥典中對于阿膠氨基酸成分的規定，采用測定多種氨基酸含量的方法綜合評定產品。

測定氨基酸的方法為高效液相色譜法或氨基酸自動分析儀法[22]，具體操作步驟參見GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》中6.3.2.2.1氨基酸自動分析儀測定方法和6.3.2.2.1高效液相色譜儀測定法測定氨基酸含量。

現今我國市售的膠原蛋白及肽類制品多為水產（淡水或海洋魚類）膠原蛋白，少量來源于牛皮和牛骨。對于水產品，由于其具有富集水中重金屬離子的作用，所以其膠原蛋白及肽類制品一般要檢測重金屬離子含量，如無機砷、甲基汞、鉛、鎘等，具體的檢測過程參見金屬離子相應的國家標準GB/T 5009.11-2014《食品安全國家標準食品中總砷及無機砷的測定》[23]，GB/T 5009.12-2017《食品安全國家標準食品中鉛的測定》[24]，GB/T 5009.15-2014《食品安全國家標準食品中鎘的測定》[25]和GB/T 5009.17-2014《食品安全國家標準食品中總汞及有機汞的測定》[26]，對于來源于牛皮和牛骨的膠原蛋白及肽類制品尚需要補充鉻的指標，以防止制革后皮料的誤入。

膠原蛋白及肽類制品的微生物檢測及感官評價的方法本文不再論述，應符合我國食品或保健食品通用衛生要求。

表2 我國膠原蛋白肽理化指標標準匯總Table 2 Physicochemical Properties index from different criterions

3 產業標準制定

目前，我國現有的膠原蛋白標準及其適用范圍的詳細介紹如下：

QB 2732－2005《水解膠原蛋白》[27]：由國家發展改革委員會于2005年7月發布的輕工行業標準，適用于以明膠為原料生產的水解膠原蛋白粉和水解膠原蛋白水溶液，主要檢測膠原蛋白產品的微生物指標和理化指標。此標準測定物質較全面，指標要求較高，但沒有對羥脯氨酸含量的限定。由于目前膠原蛋白肽生產一般以動物的皮、骨等為原料，經熱提取后加酶水解得到，而明膠是膠原蛋白肽制備過程中的一個中間產物，但并不是直接采用明膠作為初始原料提取膠原蛋白[28]，所以一定程度上導致了適用范圍上的模糊，給使用帶來了不便。

GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》國家標準：由國家質量監督檢驗檢疫總局和國家標準化管理委員會于2008年12月發布的中華人民共和國國家標準，適用于以海洋魚皮、魚骨、魚肉為原料，酶解法生產，分子量低于1 000 u的低聚肽（短肽）為主要成分的粉末狀產品。產品按類別包括海洋魚皮膠原低聚肽粉、海洋魚骨膠原低聚肽粉、海洋魚肉低聚肽粉3類。此標準測定的理化指標相對較少，要求比較寬泛，增加了分子量大小的限制，要求分子量范圍要小于1000u。

經查文獻，分子量一般不用u作單位，而是道爾頓（Da）[29]。而且對于目前膠原蛋白產品，其分子量范圍不一定會低于1 000 Da，過分強調小分子量而降低了其他理化指標的要求，在檢測中可能會出現主次顛倒的問題。

SB/T 10634－2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》：中華人民共和國商務部于2011年12月發布的國內貿易行業標準，適用于以淡水魚皮和魚鱗為原料，酶解法生產，分子量低于5 000 Da的膠原蛋白肽粉。此標準適用范圍較窄（只限于淡水魚），測定的理化指標較為全面[30]，其中首次引入游離羥脯氨酸占總羥脯氨酸的概念。與GB/T 22729－2008《海洋魚低聚肽粉》國家標準相比，其分子量放寬到低于5 000 Da。但后面具體項目要求中包含分子量低于5 000 Da的膠原蛋白肽含量不小于85%、75%、65%等，則會帶給人分子量不低于5 000 Da的另外15%、25%、35%的膠原蛋白肽部分到底適不適合本標準的疑問。

最后是較多的企業標準如Q/JYB 0065 S-2010《復配膠原蛋白粉》[31]：如由廣州金葉保健品有限公司2010年6月發布的廣東省食品安全企業標準，適用于以膠原蛋白粉，葡萄糖，植脂末為原料生產的復配膠原蛋白粉。此標準適用范圍較廣，測定物質較全面，但指標要求相對較低，同時缺少對羥脯氨酸含量的規定。

由以上分析可以看出，對于目前大量的以牛皮、豬皮、雞皮等為原料生產的膠原蛋白肽尚沒有統一的適用標準，即使對于大部分水產膠原蛋白肽，由于分子量限制，在使用上也有一定難度。

我國膠原蛋白肽理化指標標準匯總見表2。

各標準中，對于蛋白質含量均有具體的要求，標準2～4均標示采用干基含量，1號標準則沒有說明。其中標準2中蛋白質含量以總氮占干基的百分比來表示，與其他標準不同。建議統一采用蛋白質質量占樣品質量來表示。目前國內對于測定膠原蛋白中蛋白質含量使用的方法多為凱氏定氮法，換算系數為5.79。同時由表2可以看出，不同標準對于同一檢測項目，要求的具體指標之間存在差異，而且對于水分、灰分差異較大，尚無較為統一的標準。

由于羥基脯氨酸是膠原蛋白及肽類產品標志性的氨基酸，所以羥基脯氨酸含量指標是標準中需要明確規定的。另外由于膠原蛋白特殊的結構，甘氨酸是所有氨基酸中含量最多的，約占總蛋白質33%，建議補充規定樣品中甘氨酸的含量指標。

為了避免人為添加氨基酸，在標準中規定游離羥脯氨酸的含量也十分有必要，通過游離羥脯氨酸含量占總羥脯氨酸含量的數值，可以直觀準確地檢測出樣品中是否存在人為添加羥脯氨酸的造假現象。

4 結論

本文在前人研究的基礎上重點強調了膠原蛋白的稱謂界定，明確“膠原蛋白”與“膠原蛋白肽”兩種不同的概念。在制定膠原蛋白產品的國家標準上，文中對各類理化指標的制定給出了參考意見，同時建議通過幾個指標綜合評定來對膠原蛋白及其肽類制品進行定性及定量檢測，即在常見的水分、灰分、粗蛋白的基礎上增加羥基脯氨酸、甘氨酸、游離羥基脯氨酸含量、重金屬離子含量等指標的檢測，為制定更為科學規范的標準提供理論依據。

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