紅冬蛇菰化學成分預實驗及其總酚、總黃酮含量測定*

張聲源，溫正輝，李云霞，林雅立，周 銘△（.嘉應學院醫學院，廣東梅州5403；.嘉應學院醫學院附屬醫院藥劑科，廣東梅州5403）

紅冬蛇菰（Balanophora harlandii）為蛇菰科（Bala?nophoraceae）蛇菰屬（Balanophora Forst.）多年生肉質寄生草本植物，又名為“文王一支筆”和“石蓮花”，主要產于廣東、廣西和云南等省區[1]。紅冬蛇菰氣味甘苦，無毒，具有活血化瘀、清熱解毒等功效，民間常用于醒神、治酒積等[2]。我國是將蛇菰入藥最早的國家，歷代本草也有記述。其中《本草綱目》有較詳細記載：“諸名山皆有之，惟太和山采取，云乃葛之精華也。秋霜浮空，如芝、菌涌生地，其色赤脆，蓋罩類也?！盵3]作者前期對廣東省梅州市陰那山自然保護區進行了藥用植物資源調查，結果顯示，紅冬蛇菰在該自然保護區資源較為豐富，當地群眾常作為植物湯料制作藥膳用于防治糖尿病和風濕類疾??；此外，由于紅冬蛇菰外形獨特，與肉蓯蓉較為相似，當地也有部分群眾根據“以形補形”中醫養生理念將其制作為補腎藥酒[4]。然而，目前國內外對紅冬蛇菰的現代化學成分、質量標準、藥理活性等方面的研究鮮有報道，導致其民間藥用科學內涵等至今尚不明確[5]。本研究首次對紅冬蛇菰進行了化學成分系統的預實驗，初步確定了其可能含有的化學成分，以期為紅冬蛇菰植物藥用價值的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥材 紅冬蛇菰于2016年10月采自廣東省梅州市陰那山自然保護區，經嘉應學院醫學院生藥學教研室翟明教授鑒定為蛇菰科（Balanophoraceae）蛇菰屬（Balanophora Forst）多年生肉質寄生草本植物紅冬蛇菰（Balanophora harlandii）的全草，標本存放于嘉應學院醫學院天然藥物標本館（編號：20161012）。

1.1.2 試劑 蘆丁標準品購自中國藥品生物制品檢定所（批號：10080-200707，純度大于或等于98%），沒食子酸對照品購自中國藥品生物制品檢定所（批號：110831-200803，純度大于或等于98%），1 N福林-酚試劑購自上海金穗生物科技有限公司（批號：20160117）。甲醇、95% 乙醇、石油醚（60～90℃）、氨水、三氯甲烷、濃硫酸、濃鹽酸、正丁醇、鎂、醋酐、冰乙酸、碘化鉍鉀、硼酸、碘、碘化鉀、磷鎢酸、鐵氰化鉀、三氯化鋁、氫氧化鈉、間二硝基苯、硅鎢酸、三氯化鐵、磷鉬酸、氫氧化鉀、2，4-二硝基苯肼、鹽酸羥胺、乙酸鎂、氫氧化鉀、亞甲基藍、4-氨基安替比林、亞硝酰、鐵氰化鈉、明膠、3，5-二硝基苯甲酸、鋅粉、對二氨基苯甲醛、香草醛、氯化鈉、溴酚藍、茚三酮、酒石酸鉀鈉、氧化鋁、硫酸銅、吡啶、苯甲酸、甲苯、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

1.1.3 儀器 UV-1800型紫外-可見分光光度計[島津企業管理（中國）有限公司]、JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設備有限公司）、BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）、BS110s型電子分析天平（德國Sartorius公司）、N-1100V型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）、WJX-A1000型高速多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 紅冬蛇菰化學成分預實驗 按天然藥物化學成分系統預試法進行紅冬蛇菰石油醚提取液、乙醇提取液和水提取液的制備，通過傳統試管預試方法結合紙色譜法進行揮發油、油脂、蛋白質、氨基酸、糖類、黃酮、蒽醌、香豆素、木質素、皂苷、生物堿、甾體、三萜等化學成分檢測[6]。

1.2.1.1 石油醚提取液的制備 稱取粗粉20 g，置于100 mL三角燒瓶中，加石油醚60 mL，振蕩搖勻，密閉并多次振搖，室溫放置7 d，過濾，得石油醚提取液，供揮發油、油脂、甾體、三萜等成分的檢測。

1.2.1.2 乙醇提取液的制備 用“1.2.1.1”項實驗后留下的藥材，揮干石油醚，加入95%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，過濾，濾液分為兩部分：1份為乙醇提取液用作酚類、鞣質、有機酸、黃酮、蒽酮、香豆素、內酯、強心苷等成分的檢測；1份經減壓濃縮為醇浸膏，取1 g醇浸膏于10 mL試管中，加入2%氯化氫溶液3 mL，超聲溶解，過濾，得醇浸膏酸水液，用于生物堿的檢測。

1.2.1.3 水提取液的制備 用“1.2.1.2”項實驗后留下的藥材，揮干乙醇，置于200 mL三角燒杯中，加入100 mL蒸餾水，室溫浸泡過夜，濾取10 mL濾液用于氨基酸、多肽和蛋白質的檢測。剩余的浸液及藥渣在70℃水浴上熱浸1 h，過濾，濾液用于糖類、多糖及其苷類、有機酸、酚類、鞣質等成分的檢測。

1.2.2 總酚含量的測定

1.2.2.1 沒食子酸標準曲線的繪制 參照文獻[7]的方法并進行適當調整，精密稱取干燥至恒重的沒食子酸標準品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為0.2 mg/mL的沒食子酸標準溶液。分別精密吸取沒食子酸標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，各加入6 mL蒸餾水，再加入0.5 mL福林試劑，充分搖勻避光靜置5 min，再加7.5%碳酸鈉溶液2 mL，用蒸餾水定容至刻度，混勻后在40℃水浴中避光放置60 min，冷卻，于760 nm波長處測定其吸光度（A）值，以沒食子酸A值為縱坐標（Y），沒食子酸質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

1.2.2.2 總酚含量測定 準確稱取紅冬蛇菰藥材粗粉2.0 g，置于100 mL三角燒瓶中，加入95%乙醇50 mL，室溫超聲提取3次，合并濾液，濾渣洗滌3次，過濾，轉移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液0.1 mL于10 mL棕色容量瓶中，后續處理方法與“1.2.2.1”項相同，測定供試品溶液的A值。平行測定3次。

1.2.3 總黃酮含量的測定

1.2.3.1 蘆丁標準曲線的繪制 參照文獻[8]的方法并進行適當調整，精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液。分別精密吸取蘆丁標準溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，各加水至7 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置4 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置4 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，用60%乙醇稀釋至刻度，放置15 min，在510 nm處測A值，以試液空白為參比，平行測定3次。以蘆丁質量濃度為橫坐標（X），A值為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

1.2.3.2 總黃酮含量測定 準確稱取紅冬蛇菰藥材粗粉2.0 g，置于100 mL三角燒瓶中，加入95%乙醇50 mL，室溫超聲提取3次，合并濾液，濾渣洗滌3次，過濾，轉移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液2.0 mL于25 mL棕色容量瓶中，后續處理方法與“1.2.3.1”項相同，測定供試品溶液的A值。

2 結 果

2.1 化學成分預實驗 初步鑒定出供試品溶液可能含有的化學成分及其類型，見表1～3。

表1 紅冬蛇菰石油醚提取液化學反應結果

表2 紅冬蛇菰乙醇提取液化學反應結果

表3 紅冬蛇菰水提取液化學反應結果

2.2 紅冬蛇菰總酚和總黃酮含量 沒食子酸回歸方程為Y=0.105 6X+0.025 7（R2=0.997 4），表明沒食子酸含量在0.00～10.01μg/mL內呈良好的線性關系；蘆丁回歸方程為Y＝0.013 1X-0.000 3（R2=0.997 6），表明蘆丁含量在0.00～49.26μg/mL內呈良好的線性關系。根據回歸方程得紅冬蛇菰中總酚中位體積分數為19.84%，總黃酮中位體積分數為30.42%。見表4。

表4 紅冬蛇菰中總酚和總黃酮含量測定結果

3 討 論

藥用植物在其生長過程中通過代謝產生大量骨架結構多樣和生物活性廣泛的活性成分，一直是藥物研究與開發的重要來源。

據統計，1981—2014年上市的新藥中超過1/3直接或間接來源于天然產物；而在合成藥物中也有相當部分借鑒了天然產物的骨架結構或藥效團。另有統計表明，在目前全世界銷售額最高的25種藥品中有10種以上來源于天然產物或其衍生物[9-10]。

我國具有豐富的藥用植物、微生物等生物資源，且具有傳統的中醫藥理論體系，并具有長期的臨床應用經驗。因此，從藥用植物中尋找和開發創新藥物是一條適合我國新藥研究與開發的途徑。

紅冬蛇菰（Balanophora harlandii）為蛇菰科（Bala?nophoraceae）蛇菰屬植物，主產于廣東、云南等省區，具有活血化瘀、清熱解毒等功效，梅州市客家地區民間常用于防治糖尿病、婦科病和關節疼痛等病癥[5]。

由于紅冬蛇菰無人工種植，生長環境特殊，采摘周期短，加之宣傳不足。迄今為止，國內外對紅冬蛇菰的研究與開發鮮有報道，其所含活性成分尚不清楚，民間藥用的科學內涵不明確，嚴重制約了其進一步的開發、利用。

本研究首次采用化學反應鑒別方法分別對梅州市山區野生紅冬蛇菰的乙醇提取液、水提取液和石油醚提取液進行了探討，并通過多種指示劑和顯色劑的沉淀反應或顏色反應對紅冬蛇菰可能含有的化學成分進行了初步分析；采用福林-酚比色法和硝酸鋁絡合分光光度法分別測定了紅冬蛇菰乙醇提取物中總酚和總黃酮含量。結果顯示，紅冬蛇菰中可能含有多糖及其苷類、黃酮、酚類、鞣質、內酯、香豆素、甾體、三萜、油脂等多種化學成分，其中總酚中位體積分數為19.84%，總黃酮中位體積分數為30.42%。

總之，本研究初步確定了紅冬蛇菰中可能存在的化學成分，并為其化學成分、質量標準、藥理活性及藥物開發的研究提供了科學依據。

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