響應面法優化柴胡多糖提取工藝△

鄧寒霜，楊麗娜

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。味辛、苦，性微寒。具有解熱止痛、疏肝解郁，以及升舉脾胃清陽之氣的作用[1]?！吨腥A人民共和國藥典》以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為指標性成分，但柴胡皂苷并不能全面反映柴胡的藥理作用。研究證明，柴胡中所含的多糖類成分具有抗輻射、降血脂、增強免疫力等活性，可用于治療肝炎、腎炎、紅斑狼瘡、類風濕關節炎等疾病[2]。本文在單因素試驗基礎上，采用響應面法對柴胡多糖的水提醇沉法方法進行了優化，希望能為進一步研究柴胡中多糖類成分，擴大柴胡藥用范圍提供一定的幫助。

1 材料與儀器

1.1 材料

柴胡購自商洛市藥材市場，經商洛學院張小斌教授鑒定為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.的干燥根。苯酚(天津科密歐化學試劑開發中心)、濃硫酸(西安化學試劑廠)、三氯甲烷(西安化學試劑廠)、正丁醇(西安化學試劑廠)、95%乙醇(西安化學試劑廠)；D-無水葡萄糖對照品(上海金穗生物科技有限公司)。

1.2 儀器

紫外-可見分光光度計(島津UV-PC2800S)；電子天平(丹佛S-144)；旋轉蒸發儀(陜西愛信EYELA-N-1100)等。

2 方法

2.1 樣品的制備

將柴胡干燥后粉碎，過60目篩，備用。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取無水葡萄糖對照品100 mg放置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線處，搖勻，既得濃度為1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液。分別精密吸取葡萄糖對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL放置于10 mL容量瓶中，分別加水補至10 mL容量瓶刻度線處，搖勻。

2.3 標準曲線的制備

精確稱取3 g苯酚(重精餾)，放置于50 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線處，搖勻，即得濃度為6%的苯酚溶液。用1 mL移液管分別吸取2.2項下不同濃度的葡萄糖對照品溶液各1 mL置于具塞比色管中，加入1 mL的6%苯酚溶液，并迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，放在30 ℃的水浴鍋中30 min。以水作為空白對照，在490 nm處測定吸光度A[3]。以對照品濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，得到回歸方程Y=0.7431X+0.0016，r=0.999 4。試驗結果表明濃度在0.0～0.6 mg·mL-1的范圍內曲線線性良好。

2.4供試品溶液的制備

精密稱取2.0 g柴胡粉末放進圓底燒瓶中，加入25倍量的95%乙醇，在微沸條件下回流2 h進行脫脂，減壓回收乙醇。在一定溫度下，向濾渣內加入一定量的水進行回流，每提取10 min攪拌1 min中，提取一段時間后，趁熱抽濾，反復抽提數次，合并濾液，將濾液濃縮為水料比1∶1倍量的溶液。待溶液冷卻后，快速攪拌溶液并緩慢地向溶液中加入95%乙醇，使溶液含醇量達90%，密閉靜置24 h。將溶液放置在離心機中進行離心(8000 r·min-1)，棄去上清液，得柴胡粗多糖。用20 mL的蒸餾水將粗多糖沉淀全部溶解，再向溶液里加入等量的Sevage試劑，劇烈振搖30 min，離心(同上)。吸取上清液，加入上清液體積1/4的Sevage試劑，振搖30 min后離心(同上)，反復操作數次，直至將變性蛋白層除完，即得柴胡多糖溶液。用移液管吸取1 mL柴胡多糖溶液，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線處，既可得柴胡多糖供試品溶液[4-8]。按式(1)計算多糖提取率(%)：

提取率(%)=(多糖濃度×稀釋因子×濾液體積)/原料干重×100%

(1)

2.5方法學試驗

2.5.1精密度試驗 對葡萄糖對照品溶液進行5次平行測定，計算吸光度A的RSD值為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.2穩定性試驗 對同一組供試品溶液分別在密閉冷藏1、3、5、7、9、11后測定吸光度A，計算RSD值為0.9%，表明供試液在11 h內穩定。

2.5.3重復性試驗 按2.4項下的方法在相同條件下制備5份柴胡多糖供試液，測定吸光度A，計算RSD值為1.2%，表明試驗重復性良好。

2.5.4加樣回收率試驗 精密稱取已知含量(19.16%)的柴胡樣品粉末6份，每份2.0 g，分別精密加入無水葡萄糖對照品10.0 mg，按2.4項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算柴胡多糖的回收率為97.9%、RSD值為2.7%。

2.6 技術路線

本文在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken Design方法的設計原理，以多糖提取率為響應值，以單因素試驗所得最適值為中心點，采用Design-Expert.8.05進行響應面法進行優化，確定柴胡多糖的最佳工藝條件。技術路線如圖1所示。

圖1 柴胡多糖提取工藝優化技術路線

3 結果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 提取溫度 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣加入水料比10∶1量的蒸餾水，分別在60、70、80、90、100 ℃下回流提取，每提取10 min攪拌1 min，0.5 h后趁熱抽濾，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計490 nm處測定吸光度A，計算柴胡多糖提取率。

圖2 提取溫度對柴胡多糖提取率的影響

從圖2上可以看出隨著提取溫度的升高，柴胡多糖的提取率也一直在升高，在90 ℃的時候提取率增長開始變緩慢。造成這種變化的原因可能是高溫下多糖類成分會變得不穩定，長時間在高溫下提取，反而可能引起多糖提取下降，所以確定最優提取溫度為90 ℃。

3.1.2 水料比 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣分別加入水料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1量的蒸餾水，在90 ℃下回流提取，每提取10 min攪拌1 min，0.5 h后趁熱抽濾，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計490 nm處測定吸光度A，計算柴胡多糖提取率。

圖3 水料比對柴胡多糖提取率的影響

從圖3上可以看出隨著水料比的升高，提取率也一直在升高，在水料比為30∶1的時候提取率增長開始變緩慢。分析造成這種變化的原因可能是越多的溶劑越有利于多糖成分的溶出，但當溶劑量達到一定水平后，多糖成分已經充分溶出，再增加提取溶劑無助于增加多糖提取率，所以確定最優水料比為30∶1。

3.1.3 提取時間 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣加入水料比30∶1量的蒸餾水，在90 ℃下回流提取，每提取10 min攪拌1 min，分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后趁熱抽濾，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計490 nm處測定吸光度A，計算柴胡多糖提取率。

圖4 提取時間對柴胡多糖提取率的影響

從圖4上可以看出隨著提取時間的升高，提取率也一直在升高，在2.0 h的時候提取率最高，超過2.0 h后提取率開始降低。分析造成這種變化的原因可能是隨著提取時間的增加，多糖成分可以更加充分的溶出，但當時間超過2.0 h，在一定溫度下過長的提取時間導致多糖類成分被破壞，所以確定最優提取時間為2.0 h。

3.1.4 提取次數 精密稱取柴胡粉末2.0 g，加入95%乙醇在80 ℃的條件下回流2 h，棄去乙醇。濾渣加入水料比30∶1量的蒸餾水，在90 ℃下回流提取，每 10 min攪拌1 min，2.0 h后分別重復浸提1次、2次、3次、4次、5次，濃縮溶液，加入Sevage試劑，除盡蛋白，在紫外分光光度計490 nm處測定吸光度A，計算柴胡多糖提取率。

圖5 提取次數對柴胡多糖提取率的影響

從圖5可以看出提取2次之后，提取率變化不大?？紤]到實際應用中要注意溶劑用量和濃縮濾液的問題，所以確定最優提取次數為2次。

3.2 響應面試驗

3.2.1試驗設計 根據單因素試驗結果，2次提取后，柴胡中大部分多糖成分已充分溶出。因此，在進行響應面試驗時將提取次數固定為2次，不再進行考察，以柴胡多糖提取率為響應值，選取提取溫度、水料比、提取時間三個影響因素進行三因素三水平的試驗，因素水平設計見表3[9-14]。

表3 響應面試驗的因素水平

運用Design-Expert.8.05軟件，進行響應曲面法設計優化試驗的方案，得到17組試驗方案，具體結果見表4。

表4 試驗方案和結果

3.2.2試驗結果分析 利用響應面軟件處理數據可得方差分析結果(具體結果見表5)，以及試驗變量與響應值間的回歸方程Y=18.99+1.20A+0.39B+0.072C-0.16AB-0.22AC-0.20BC-1.22A2-0.35B2-0.14C2。所得模型對響應值影響極顯著(P<0.01)，具有較高的可信度；相關系數r=0.983 6，校正系數R2Adj=0.925 4，說明該模型能解釋92.54%的響應變化，即模型與實際情況擬合較好。三個因素中提取溫度對響應值具有極顯著影響，對試驗結果的影響最大，其次為水料比，影響最小的是提取時間。

表5 方差分析

注：*.P<0.05為顯著；**.P<0.01為極顯著。

響應面法可以比較直觀的反應出各個試驗因素對試驗結果影響的大小以及各試驗因素之間的關系，具體見圖6～8。

由圖6～8可以看出，提取溫度與水料比、提取溫度與提取時間、水料比與提取時間的交互作用對提取率具有顯著性影響。分析圖6、圖7可知，溫度曲線的變化比水料比、時間曲線劇烈，說明溫度因素對試驗的影響大于其它兩因素；分析圖8可知，水料比曲線的變化比時間曲線劇烈，表明水料比因素對試驗的影響大于時間因素。結果與由表5所得結論相符。

利用響應面軟件中的Numerical選項卡對回歸方程式2進行偏導數分析，可知柴胡多糖的最佳提取工藝為提取溫度95.02 ℃、水料比46.27∶1、提取時間1.7 h，預測最大提取率為19.39%。

圖6 提取溫度與水料比交互作用的等高線與響應面

圖7 提取溫度與提取時間交互作用的等高線與響應面

圖8 水料比與提取時間交互作用的等高線與響應面

為便于操作，對上述提取工藝稍作調整，進行驗證試驗。在固定提取次數為2次的基礎上，設定提取溫度為95 ℃、水料比為45∶1，提取時間為1.5 h，進行3組平行試驗，得到平均提取率為19.16%，與理論值19.39%相近，說明該模型可以很好的預測試驗的實際表達情況。

4 結論與展望

本文在單因素試驗基礎上結合響應面法，重點研究了提取時間、水料比、提取溫度三個因素對柴胡多糖提取率的影響。經優化后提到柴胡多糖的最佳提取工藝參數為：提取溫度為95 ℃、水料比為45∶1、提取時間為1.5 h，重復提取2次。

植物多糖因其具有多種生理活性，近年來成為植物成分提取方面研究的熱點。但因植物多糖中含有較多脂質、蛋白質、色素、鹽類等其它物質[15]，對其分離純化工藝要求較高。在今后的研究中，我們將對柴胡多糖的純化工藝做進一步研究，以期柴胡多糖的開發利用奠定一定的基礎。

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