榛子殼棕色素的抗氧化、抑菌活性及其初步定性分析

劉暢，曠慧，姚麗敏，王金玲

(東北林業大學林學院，哈爾濱 150040)

榛子屬于榛科(Corylaceae)榛屬(Corylus)多年生灌木樹種，果實形似栗子，外殼堅硬，果仁肥白而圓，有“堅果之王”的稱呼，與扁桃、胡桃、腰果并稱為“四大堅果”[1]。榛子殼是榛子加工生產中的廢棄物，其中含有大量的天然棕色素，可變廢為寶，將榛子殼棕色素廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等行業中[2-3]。因此，研究榛子殼棕色素對榛子殼資源的有效利用具有一定的實用價值。

隨著人們對天然色素的研究，發現其具有抗癌、抗衰老、清除自由基、抑菌等活性功能[4-5]，天然色素的制備及其功能分析成為當前研究的熱門。榛子殼棕色素水溶性好，性質較穩定[6]，可以作為天然色素應用于飲料、糕點、醬油等食品行業。本研究測定了榛子殼二次純化色素，一次純化色素及未純化色素的抗氧化活性、抑菌功能，并以二次純化后的榛子殼棕色素為試驗對象，研究了榛子殼棕色素的特征顯色反應和紫外光譜吸收峰，為榛子殼棕色素能作為功能性色素在食品、化妝品等行業的應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

毛榛子(CorylusmandshuricaMaxim.)購自伊春市五營林業局，手工去仁，榛子殼烘干(40℃)粉碎，備用；DPPH購自Sigma公司；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、青霉、啤酒酵母、果酒酵母均為本實驗室保藏菌種。ALC-1104分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-1200紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；DHG-9030A型電熱鼓風干燥箱(鞏義市予華儀器有限責任公司)；PG-280B型恒溫培養箱(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)；SW-CJ-18標準型凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)。

1.2 方法

1.2.1 榛子殼棕色素的制備

參照文獻制備方法制得榛子殼棕色素粗提液[7]。將榛子殼棕色素粗提液(色價為22.3 ± 3.2)在上樣質量濃度為30mg/mL，上樣流速為1.5～2.0mL/min，洗脫劑為70%的乙醇，洗脫流速為1.5～2.0mL/min的條件下，經D101大孔樹脂對榛子殼棕色素粗提液進行一次純化，得一次純化色素(色價為46.8±2.37)；而后在上樣質量濃度為22mg/mL，上樣流速為1.5mL/min，洗脫劑(乙醇)的體積分數為80%，洗脫流速為2.5mL/min的條件下，經D101大孔樹脂對一次純化色素進行二次分離純化，得二次純化色素(色價為82.61±2.26)。通過參考文獻測定色素的色價，公式如下[8]：

式中，A為吸光度；W為100mL被測溶液中所含樣品的質量(g)；R為100mL溶液稀釋至上機測試的稀釋倍數；表示樣品濃度為1%，1cm比色皿測得的色價值。

1.2.2 榛子殼棕色素的抗氧化活性

1.2.2.1 ·OH清除能力的測定。采用水楊酸比色法[9]，略有改進。將1.0mL、6mmo1/L的FeSO4溶液，1.0mL、8mmol/L的H2O2溶液，l.0mL不同質量濃度的未純化色素溶液，一次純化色素溶液，二次純化色素溶液和抗壞血酸溶液，l.0mL、6mmol/L的水楊酸鈉溶液依次加入試管，反應混合物體系共4.0mL?；靹蚝箪o置30min，利用分光光度計于562nm測吸光度?！H清除率用下式計算：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A0為空白組的平均吸光度；A1為試樣的平均吸光度；A2為樣品本身吸光度。

1.2.2.2 DPPH·清除能力的測定。參照文獻的方法[10]，略有改進。配制0.2mmol/L DPPH乙醇溶液，放在棕色試劑瓶中于4℃保存。在試管中加入2mL DPPH乙醇溶液及2mL樣品溶液和抗壞血酸溶液，混合均勻在室溫避光放置30min，于517nm波長下用無水乙醇調零，并測定吸光值A1；將DPPH乙醇溶液用等體積的無水乙醇代替，其他操作相同，測定吸光值A2；將樣品溶液用等體積無水乙醇溶液代替，其他操作相同，測定吸光值A0。清除率用下式計算：

DPPH·清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A0為空白組的平均吸光度；A1為試樣的平均吸光度；A2為樣品本身吸光度。

1.2.2.3 總還原力的測定。采用鐵氰化鉀還原顯色法[11]，略有改進。分別取1mL不同濃度的樣品和抗壞血酸溶液于試管中，依次加入2.5mL，0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.6)和2.5mL，1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50℃水浴保溫20min后，快速冷卻，再加入10mL，10%的三氯乙酸，離心，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水、0.5mL，0.1%的三氯化鐵，充分混勻，在700nm下測其吸光值(以蒸餾水作調零空白)。

1.2.3 榛子殼棕色素的抑菌活性

1.2.3.1 供試菌株的準備。無菌室中將供試菌種移接入試管斜面培養基上，并置于36～37 ℃(真菌、酵母在28 ℃)恒溫培養箱內培養24h(真菌、酵母為48h)活化菌種，0～4 ℃冷藏備用；分別用接種環挑取少許菌體于裝有無菌生理鹽水的試管內，振蕩均勻，制成菌懸液，用血球計數板計數，調整菌懸液的濃度，使其含菌體為107～108個/mL，即得供試菌懸液[12]。

1.2.3.2 濾紙片法測定抑菌作用。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、果酒酵母、啤酒酵母、青霉、黑曲霉為指示菌[13]，在超凈工作臺上將滅菌后的固體培養基倒入無菌培養皿中，每皿15～20mL，待冷卻凝固后，用移液槍將200μL菌懸液加到平皿上，用涂布棒將菌液涂布均勻，再用無菌鑷子夾取浸透色素溶液的濾紙片(濾紙片直徑6mm)，將其貼在含菌平板上，每皿貼4片(榛子殼棕色素溶液濾紙片3片，無菌水濾紙片1片)。將培養皿在適宜的溫度下培養一定時間(細菌，37 ℃，24 h；酵母菌，28 ℃，48 h；霉菌，28 ℃，72 h)后，觀察微生物生長情況[14-15]。

1.2.3.3 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉最低抑菌濃度MIC的測定。配制質量濃度為30、15、7.5、3.75mg/mL的一次純化色素、二次純化色素溶液，以大腸桿菌，黑曲霉，枯草芽孢桿菌為指示菌，采用上述方法進行抑菌試驗，觀察微生物生長情況，并測定抑菌圈直徑。

1.2.4 二次純化后榛子殼棕色素的初步定性分析

1.2.4.1 二次純化后榛子殼棕色素的顯色反應

a 鹽酸-鎂粉反應[16]：取二次純化后的榛子殼棕色素溶液1mL于試管中，加人0.1g鎂粉，然后再加5滴濃鹽酸，水浴加熱，觀察現象(另一試管供試液僅加濃鹽酸進行觀察，以排除本身的顏色)。

b 硼酸顯色反應[16]：取1mL二次純化后的榛子殼棕色素溶液，先滴加2%檸檬酸甲醇溶液，再滴加飽和硼酸溶液，觀察色素顏色變化，并將此色素混合溶液滴在濾紙上，蒸干后于紫外燈下觀察。

c 與金屬鹽類反應[17]：取二次純化后的榛子殼棕色素溶液1mL，滴加1%三氯化鐵溶液，觀察顏色變化。

d 氫氧化鈉試驗[16]：用滴管取二次純化后的榛子殼棕色素溶液滴于濾紙上，吹干，噴4%氫氧化鈉溶液，吹干后觀察現象。

1.2.4.2 二次純化后榛子殼棕色素的紫外-光譜掃描分析。準確稱取0.10g二次純化后的榛子殼棕色素凍干粉，將其溶于10mL甲醇中，稀釋后配制成質量濃度為1mg/mL的棕色素溶液，在200～500nm范圍內進行波長掃描；取3mL 1mg/mL的榛子殼棕色素甲醇溶液，分別加入1mL質量濃度為10%的甲醇鈉、醋酸鈉/硼酸溶液[18]，在200～500nm范圍內進行波長掃描。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次，數據結果表示為平均值±標準差(SD)。不同純化次數的榛子殼棕色素進行“One-Way ANOVA”方差分析，P<0.05認為具有統計學顯著性差異。數據采用spss19.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 榛子殼棕色素的抗氧化活性

2.1.1 ·OH清除能力的測定

榛子殼棕色素對·OH的清除能力如圖1所示。

圖1 榛子殼棕色素清除羥基自由基的效果

由圖1可知二次純化色素，一次純化色素，未純化色素對·OH均有清除作用，在濃度為0.1～0.2mg/mL時，二次純化色素對·OH的清除能力明顯優于抗壞血酸，并且在設定的受試物濃度范圍內，榛子殼棕色素對·OH的清除能力隨其濃度的增加而上升。

對圖中二次純化色素，一次純化色素，未純化色素和抗壞血酸的清除·OH抗氧化曲線進行線性模擬回歸處理，它們清除·OH的IC50值見表1。

表1 榛子殼棕色素清除·OH能力結果分析

注：其中，Y：清除率(%)，x：樣液濃度(mg/mL)，下同。Sig.：回歸關系的顯著性系數，Sig.≤0.05，說明回歸關系具有統計學意義，下同。

由表1可知，線性模擬方程的相關系數R2值說明二次純化色素、一次純化色素及抗壞血酸濃度對·OH清除率的線性關系很好，但是未純化色素濃度與·OH清除率線性關系稍差，可能是由于未純化色素中雜質過多，隨著濃度的增加，其雜質也增加，從而對榛子殼棕色素的抗氧化能力造成干擾[20]。由IC50值可知，樣品對·OH清除能力順序為：抗壞血酸>二次純化色素>一次純化色素>未純化色素；隨著純化次數的增加，其清除·OH能力增強，說明D101大孔樹脂純化后的榛子殼棕色素，其清除·OH的能力增強。

表2 榛子殼棕色素清除·OH能力結果對比分析

注：*均值差的顯著性水平為0.05，下同。

采用Dunnett t(雙側)a法對未純化色素，一次純化色素，二次純化色素清除·OH能力結果進行“One-Way ANOVA”方差分析，A組：二次純化色素，B組：一次純化色素，C組：未純化色素，C組為對照組，將其與A、B兩組進行兩兩比較，下同。分析結果如表2。

由表2可知，在試驗濃度范圍內，A與C、B與C雙尾T檢驗概率值P<0.05，則A與C、B與C之間的差異均為顯著。試驗結果表明，純化后的榛子殼棕色素清除·OH的能力比未純化色素顯著增強(P<0.05)。

2.1.2 DPPH·清除能力的測定

榛子殼棕色素對DPPH·的清除能力如圖2所示。

圖2 榛子殼棕色素清除DPPH·的效果

由圖2可知，榛子殼棕色素對DPPH·的清除能力雖弱于抗壞血酸，但仍表現出良好的清除活性，且在一定濃度范圍內其清除率與濃度呈量效關系；并且隨著純化次數的增加，其清除DPPH·的能力也明顯提高，可能原因是經D101純化后的榛子殼棕色素，去除了部分雜質，提高了其純度，從而提高了對DPPH·的清除能力[21]。

對圖中二次純化色素，一次純化色素，未純化色素和抗壞血酸的清除DPPH·抗氧化曲線進行線性模擬回歸處理，它們清除DPPH·的IC50值見表3。

表3 榛子殼棕色素清除DPPH·能力結果分析

由結果分析表3可知：二次純化色素、一次純化色素、未純化色素及抗壞血酸濃度對DPPH·清除率的線性關系較好，由IC50值可知，樣品對DPPH·清除能力順序為：抗壞血酸>二次純化色素>一次純化色素>未純化色素；隨著純化次數的增加，其清除能力增強，說明經過D101大孔樹脂純化后的榛子殼色素，其清除DPPH·的能力增強。

采用Dunnett t(雙側)a法對未純化色素，一次純化色素，二次純化色素的清除DPPH·結果進行“One-Way ANOVA”方差分析，分析結果如表4。

表4 榛子殼棕色素清除DPPH·結果對比分析

由表4可知，在樣液濃度為0.05mg/mL和0.1mg/mL時，B與C雙尾T檢驗概率值P>0.05，說明在這兩個濃度下，B與C之間的差異不顯著(P>0.05)；在濃度為0.2～0.6 mg/mL時，B與C雙尾T檢驗概率值P<0.05，B與C之間的差異顯著(P<0.05)；在試驗濃度范圍內，A與C雙尾T檢驗概率值P<0.05，則A與C之間的差異均為顯著(P<0.05)。試驗結果表明，純化后的榛子殼棕色素清除DPPH·的能力強于未純化色素；且二次純化后的榛子殼棕色素清除DPPH·的能力顯著增強，一次純化后的色素在濃度為0.2～0.6mg/mL時，其清除DPPH·能力也均強于未純化色素。

2.1.3 總還原力的測定

榛子殼棕色素的總還原力如圖3所示。

圖3 榛子殼棕色素的總還原力

由圖3可知，在試驗濃度范圍內，榛子殼棕色素表現出一定的還原能力，且隨著濃度的增加，吸光值均增大，表明其還原能力增強，且具有劑量依賴性。二次純化色素的總還原力明顯優于一次純化色素及未純化色素，但3種榛子殼色素的總還原力弱于抗壞血酸。

對圖中二次純化色素，一次純化色素，未純化色素和抗壞血酸的總還原力曲線進行線性模擬回歸處理，結果見表5。

表5 榛子殼棕色素的總還原力結果分析

由結果分析表5可知：二次純化色素、一次純化色素及抗壞血酸濃度對總還原能力的線性關系好，未純化色素濃度與總還原能力線性關系相對較弱。

采用Dunnett t(雙側)a法對未純化色素，一次純化色素，二次純化色素的總還原能力結果進行“One-Way ANOVA”方差分析，結果如表6。

表6 榛子殼棕色素的總還原能力結果對比分析

由表6可知，在樣液濃度為0.1mg/mL時，B與C雙尾T檢驗概率值P>0.05，B與C差異不顯著(P>0.05)；在濃度為0.2～0.6mg/mL時，B與C雙尾T檢驗概率值P<0.05，B與C之間差異均顯著(P<0.05)；在試驗濃度范圍內，A與C雙尾T檢驗概率值P<0.05，說明A與C之間差異均為顯著(P<0.05)。試驗結果表明，純化后的榛子殼棕色素總還原能力比未純化色素顯著增強。

2.2 榛子殼棕色素的抑菌活性

榛子殼棕色素的抑菌活性如表7、表8所示。

表7 榛子殼棕色素對供試菌株的抑菌活性

注：“+”表示有抑菌效果；“-”表示無抑菌效果，下同。

由表7可知，在試驗濃度范圍內，未純化色素沒有抑菌活性，而一次純化色素對大腸桿菌、黑曲霉的生長有抑制作用，二次純化色素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的生長有抑制作用。

表8 榛子殼棕色素的最低抑菌濃度

由表8可知，一次純化色素及二次純化色素對大腸桿菌的最低抑菌濃度均為15mg/mL，但是二次純化色素對大腸桿菌的抑菌圈大于一次純化色素，說明二次純化色素對大腸桿菌的抑制作用優于一次純化色素；一次純化色素對黑曲霉的最低抑菌濃度為30mg/mL，而二次純化色素對黑曲霉的最低抑菌濃度為15mg/mL；因此，二次純化色素對黑曲霉的抑制作用優于一次純化色素；二次純化色素對枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度為30mg/mL。此外，一次純化色素對大腸桿菌的抑制作用優于黑曲霉；二次純化色素對大腸桿菌的抑制作用最明顯，其次為黑曲霉、枯草芽孢桿菌。

2.3 二次純化后榛子殼棕色素的初步定性分析

2.3.1 二次純化后的榛子殼棕色素的顯色反應

對榛子殼棕色素進行了黃酮類化合物特征顯色反應，其結果如表9所示。

表9 榛子殼棕色素的顯色反應結果

濃鹽酸-鎂粉試驗是黃酮類化合物特征性試驗，多數黃酮醇、二氫黃酮和二氫黃酮醇類色素經過鹽酸-鎂粉反應顯示紅-紫紅色[22]。 由表9可知，榛子殼棕色素與濃鹽酸-鎂粉反應現象表明該色素中可能含黃酮(醇)類，二氫黃酮(醇)類；在與硼酸顯色反應中，榛子殼棕色素溶液呈黃色，并且在紫外燈下有黃色熒光，說明榛子殼棕色素中有5-OH[23]；與FeCl3溶液的顯色反應現象表明，榛子殼棕色素中含有酚羥基的特征性反應[24]，而酚羥基是黃酮類化合物分子結構官能團之一；在與氫氧化鈉溶液反應現象表明榛子殼棕色素中可能含黃酮類化合物[16]。因此，棕色素進行定型實驗，證明榛子殼棕色素是黃酮類化合物。

2.3.2 二次純化后的榛子殼棕色素甲醇溶液的紫外-光譜分析

二次純化后的榛子殼棕色素甲醇溶液的紫外-光譜分析見圖4。

圖4 二次純化后的榛子殼棕色素的紫外-光譜分析

黃酮化合物在200～400nm間有2個主要的紫外吸收帶，在300～400nm處的Ⅰ帶由B-環肉桂酰系統引起，在220～280nm處的Ⅱ帶由A-環苯酰系統引起[25]。由圖5可知，二次純化后的榛子殼棕色素甲醇溶液在220～280nm處和300～400nm處均有吸收峰，可進一步判斷榛子殼棕色素含黃酮類物質。加入診斷劑醋酸鈉和硼酸后，帶Ⅰ紅移24nm，推斷其B環上有鄰二羥基[25]。加入診斷劑甲醇鈉后，吸收帶Ⅱ沒有發生變化，帶Ⅰ紅移了30nm，同時吸收強度下降，推斷其結構中可能有3-OH，無4′-OH[26]；但由于該色素是混合物，無法準確判斷其黃酮種類，仍需在此試驗結果的基礎上結合更加精確、靈敏的實驗分離方法(如薄層層析、凝膠柱層析等)和鑒定方法(如高效液相色譜法、質譜法和核磁共振等)對該色素中的組成成分進行定量和定性分析。

3 結論與討論

研究結果表明在一定濃度范圍內，二次純化色素，一次純化色素及未純化色素對·OH、DPPH·均有清除能力和具有還原力，表明三者均具有抗氧化活性，但二次純化色素的抗氧化能力顯著優于一次純化色素及未純化色素。抑菌性試驗結果表明，二次純化色素對黑曲霉、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現出抑菌活性，MIC分別為15、30和15mg/mL；一次純化色素對黑曲霉及大腸桿菌表現出抑菌活性，MIC分別為30、15mg/mL，未純化色素對供試菌株無抑菌作用。定性分析結果表明榛子殼棕色素含黃酮類化合物。表明榛子殼棕色素具有抗氧化活性、抑菌活性，且通過大孔樹脂純化能增強其生物學活性。榛子殼棕色素中含有黃酮類物質，但仍需進一步試驗鑒定其組成成分。

黃酮類化合物是以C6-C3-C6結構為基本母核的天然產物，骨架中含有兩個苯環，由C3部分橋連，C3部分可以是脂肪鏈，也可以與C6部分形成六元或五元氧雜環[27]。黃酮類化合物結構中的B環(圖5)是其發揮生物學功能的主要活性部分，B環上存在鄰二羥基時，使其抗氧化活性得到了大大提高[28]。經試驗證明，二次純化后的榛子殼棕色素的抗氧化活性、抑菌活性均比未純化及一次純化的榛子殼棕色素強，可能原因是經過兩次純化后榛子殼棕色素中的活性成分如黃酮類物質被富集，其結構中的酚羥基能提供更多的質子，能與更多的自由基相結合，或在更低的濃度下抑制細菌增殖，從而使其生物活性增強[29]。

圖5 黃酮類化合物普通結構

Dunnett t(雙側)a法視1個組為控制組，將其與所有其他組進行比較，適用于k個處理組與1個對照組均數差異的多重比較，當組間方差不齊時適合此法檢驗；當k值較小時，通過試驗組與對照組的兩兩對比，能簡便、準確體現不同處理間是否具有差異性[30]。在研究二次純化、一次純化和未純化榛子殼棕色素抗氧化活性差異時，根據試驗結果繪制的曲線圖能直觀地判斷三者之間抗氧化活性的差異，但無法判斷差異之間的顯著性。由試驗曲線模擬線性方程，由線性方程的相關系數R2只能判斷該模型的擬合效果；但通過Dunnett t(雙側)a法分析，能根據均值差結果來判斷3組試驗間的差異顯著性，從統計學上來分析純化后與未純化后的榛子殼棕色素抗氧化活性之間的差異是否顯著。

本研究通過特征顯色反應和紫外-紅外光譜分析初步鑒定出二次純化后的榛子殼棕色素中含有黃酮類化合物，但其他組分及含量仍需進一步研究。本研究也通過高效液相色譜法(HPLC)對二次純化后的榛子殼棕色素進行了結構鑒定，但均未與蘆丁、沒食子酸、槲皮素、山奈酚、兒茶素、表兒茶素、綠原酸等標準品的保留時間配對成功。目前國內外對榛子殼棕色素的組成成分和結構研究較少，但對于榛子種皮棕色素的組成成分和結構有報導。?zdemir等[31]通過提取榛子皮(Tombul品種，生長地土耳其)棕色素并對其組分成分進行了研究，結果表明榛子種皮棕色素中含有酚類物質(33mg/g，以沒食子酸計)，HPLC結果表明該酚類物質中含有蘆丁、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素、沒食子酸和沒食子兒茶素沒食子酸酯。本研究仍然需要通過改變榛子殼棕色素的提取和分離條件、HPLC的洗脫條件、流動相組成，同時結合質譜分析法對榛子殼棕色素的組成成分和結構進行進一步鑒定。

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