TNBS誘導結腸炎小鼠中細菌鞭毛蛋白的表達及其與肥大細胞脫顆粒的關系*

路 瑤，郝卉杰，賀 欣，張目涵，趙美華，馬 娜，馮百歲

(鄭州大學第二附屬醫院消化內科， 炎癥性腸病中心， 吳階平醫學基金會， 炎癥性腸病聯盟河南省炎癥性腸病中心， 河南 鄭州 450014)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組以腹痛、腹瀉及黏液膿血便等為主要臨床表現的慢性炎性疾病，其病因尚不明確?，F有的研究表明IBD與腸黏膜屏障破壞以及異常免疫應答相關[1]。目前研究表明腸道炎癥的發生與腸道內菌群的作用密不可分[2]。正常人腸道內即存在大量的抗原物質, 包括正常定植菌群、某些致病菌和細菌毒素等[3]，這些抗原物質可誘導腸黏膜產生大量炎癥細胞，同時導致免疫功能紊亂，從而在IBD的發生發展過程中發揮作用[4]。 細菌鞭毛蛋白CBir1可與Toll樣受體5(Toll-like receptor 5，TLR5)等受體結合，激發相應的信號轉導通路，從而參與腸道慢性炎癥反應[5]。肥大細胞是黏膜免疫的重要組成部分，目前研究發現在IBD患者的腸黏膜中活化的肥大細胞增多。激活的肥大細胞發生脫顆粒作用，可分泌出肥大細胞類胰蛋白酶(mast cell tryptase，MCT)及組胺等細胞因子進一步促進炎癥反應發生[6-7]。細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠直接損傷細胞，當其與卵清蛋白(ovalbumin，OVA)結合后可促進炎癥反應[8]。酮替芬(ketotifen)是一種常見的抗過敏藥物，其能夠穩定肥大細胞細胞膜，從而減少炎癥物質的釋放。人類IBD的炎癥反應過程尚不明確，通過動物實驗可模擬該疾病發病過程。本實驗采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導建立小鼠慢性結腸炎模型，并對各組小鼠采取相應的干預措施。實驗中采用免疫組織化學以及ELISA方法來檢測各組腸黏膜組織及血清中CBir1、TLR5、組胺及MCT的表達，分析疾病進程中上述指標含量的變化,并結合分析CBir1的含量與上述肥大細胞脫顆粒相關指標之間的相關性，分析兩者在TNBS誘導小鼠結腸炎中的作用，為臨床IBD的研究和疾病的治療提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料

健康雄性6～8周齡SPF級BALB/c小鼠72只，體重18～22 g，購自河南省動物實驗中心,實驗動物質量合格證許可證號為SCXK(豫)2010—0002。LPS、TNBS、OVA、富馬酸酮替芬購自Sigma；小鼠類胰蛋白酶、組胺以及抗CBir1抗體ELISA試劑盒購自R&D；過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購自博奧森生物技術有限公司；兔抗小鼠CBir1抗體和TLR5抗體購自UCL；兔抗小鼠類胰蛋白酶β2抗體購自福州邁新生物科技公司。

2 方法

2.1實驗分組和處理 實驗小鼠共分為6組，每組各12只，隨機分為：(1)正常對照(normal control)組：無特殊處理，正常飼養; (2)生理鹽水(saline)組：禁食不禁水24 h，實驗第1、8和15天給予生理鹽水(100 μL)灌腸，實驗后正常飲食；(3)50%乙醇(50% alcohol)組：第1、8和15天給予50%乙醇(100 μL)灌腸;(4)50%乙醇+TNBS (50% alcohol+TNBS)組：第1、8和15天分別給予由2.0 mg TNBS、2.5 mg TNBS和3.0 mg TNBS加50%乙醇配置成的100 μL溶液灌腸； (5) 50%乙醇+TNBS+酮替芬(50% alcohol+TNBS+ketotifen)組：用生理鹽水加酮替芬0.5 mg配成100 μL溶液，給予該組小鼠腹腔注射，30 min后灌腸，TNBS劑量及灌腸方法同(4)組; (6) 50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組：取OVA 20 μg和LPS 10 μg溶于100 μL 生理鹽水中，于第7天給予該組小鼠腹腔注射，第9、12及15天重復上述過程,后將OVA 50 μg溶于100 μL生理鹽水配成溶液，于第18、19、20和21天按每只100 μL的劑量行腹腔注射，TNBS劑量和灌腸方法同(4)組。實驗第22天處死小鼠，收集血液并離心20 min(2 000～3 000 r/min)后取上清儲存至-20 ℃;取小鼠結腸組織，4%甲醛固定，石蠟包埋并凍存，待后續實驗使用。

2.2病理評分 根據Irving等[9]提出的疾病活動指數評分(disease activity index，DAI)標準對各組小鼠一般情況進行評估并取各組平均值為DAI分值。組織學損傷評分(histological index，HI):取小鼠結腸組織的石蠟切片，根據Ewaschuk等[10]的標準對小鼠結腸進行HI評估,讀片及評分采用雙盲法，結果取均值。

2.3免疫組化法檢測結腸組織內CBir1、TLR5和MCT的表達 取小鼠結腸組織石蠟切片，并通過免疫組化的方法檢測各組組織內TLR5、 CBir1及MCT含量，并采用定性標準進行判定。具體實驗方法為：石蠟切片水化→抗原修復→3% H2O2孵育→血清封閉→加I抗過夜→復溫→加II抗→加辣根酶標記鏈霉卵白素→避光滴加DAB顯色劑→自來水沖洗終止顯色→蘇木素復染→70%鹽酸乙醇分化→脫水→樹膠封片。具體判定標準為：(1)陽性細胞≤5%計為0分，6%～25%計為l分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，>75%計為4分；(2)陽性強度：無色計為0分，淡黃色計為1分，黃色計為2分，棕黃色計為3分；將(1)和(2)兩者積分相乘，0分視為陰性(-)，1～4分視為弱陽性(+)，5～8分視為陽性(++)，9～12分視為強陽性(+++)。上述結果均為在高倍鏡(×400)下觀察得出，每個標本觀察5個不重復視野，結果取平均值。

2.4血清抗-CBir1抗體、MCT和組胺的ELISA檢測 采用ELISA檢測各組小鼠血清中MCT、抗-CBir1抗體及組胺的含量。根據標準物吸光度(A)值及對應的濃度，得出標準曲線回歸方程式。將測得的各組的A值，代入方程式中，得各組樣品的實際濃度。

3 統計學處理

數據經SPSS 21.0 統計軟件處理。對稱分布計量數據采用均數±標準差(mean±SD)進行描述。正態分布計量數據采用Levene檢驗法檢驗方差齊性，并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差分析有意義者采用SNK-q法進行兩兩比較。非正態分布計量數據采用Bonferroni法進行兩兩比較。定性資料的兩兩比較采用秩和檢驗。變量間相關性描述采用Pearson積矩相關系數。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠一般狀況及DAI評分比較

分別記錄各組小鼠實驗開始后一般情況變化，正常對照組小鼠的飲食及飲水均正常，精神狀態未見明顯異常，體重增加，無死亡；生理鹽水組10%～15%小鼠稀便，其余同正常對照組；50%乙醇組實驗開始后約20%的小鼠飲食量減少、排稀便，約10%的小鼠出現潛血+～++，體重減輕，1周后逐漸恢復體重,死亡率為0；50%乙醇+TNBS組實驗開始后出現食量減少、排軟便或稀便，大便潛血+～+++，精神萎靡、體重下降，且第3周達癥狀高峰,灌腸開始后第1、2周出現動物死亡現象,死亡率16.67%；50%乙醇+TNBS+酮替芬組小鼠實驗開始后癥狀較50%乙醇+TNBS組輕，第8天體重恢復90%左右，小鼠死亡率8.33%；50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組動物上述癥狀嚴重，體重下降較為明顯,死亡率25%。小鼠體重下降情況及DAI評分比較見圖1。

Figure 1. The results of body weight loss and DAI score in each group of mice. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vs50% alcohol+TNBS group.

圖1各組小鼠體重下降情況及DAI評分結果的比較

2 各組小鼠結腸黏膜組織學改變及HI評分比較

用放大鏡對各組小鼠的腸道組織進行初步觀察,正常對照組、生理鹽水組及50%乙醇組腸黏膜較平滑、未見明顯充血腫脹及明顯淋巴濾泡增生；各模型組腸黏膜見顆粒狀突起，部分結腸見扭曲變形、充血及少量黏膜糜爛。

光鏡下組織切片可見：正常對照組和生理鹽水組小鼠腸黏膜上皮細胞連續，腺體結構清晰，排列規則，未見炎癥細胞浸潤；50%乙醇組腸黏膜上皮細胞連續, 黏膜層見少量淋巴細胞浸潤，腺體結構無明顯破壞；50%乙醇+TNBS組腸黏膜欠完整，腸上皮細胞破碎，杯狀細胞數量減少，淋巴濾泡數量增多，固有層炎癥細胞浸潤,病變較嚴重區域，可見腸上皮小片狀壞死，黏膜下層及固有肌層均見小血管增生；50%乙醇+TNBS+酮替芬組腸黏膜缺乏完整性，腸上皮細胞破裂，杯狀細胞減少，黏膜層存在淋巴細胞浸潤，肌層亦可見少量炎癥細胞；50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組小鼠組織損傷程度較50%乙醇+TNBS組嚴重，炎癥侵犯全層，大量腺體結構消失，部分見固有層增厚。各組小鼠結腸黏膜進行HI評分并比較見圖2。

Figure 2. The results of HI soore in each group of mice. Mean±SD.n=12.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vs50% alcohol+TNBS group.

圖2小鼠腸黏膜組織HI評分比較

3 各組小鼠結腸黏膜CBir1、TLR5和MCT的表達

免疫組化結果顯示CBir1在結腸組織分布于腸上皮細胞膜，而MCT及TLR5分布于結腸組織腸上皮細胞質中。根據陽性細胞百分比及染色程度判定結果，可見各組結腸組織的染色程度明顯不同，其中，50%乙醇+TNBS組中CBir1、MCT和TLR5較正常對照組陽性數增多(P<0.05),加入酮替芬后CBir1和TLR5陽性數較50%乙醇+TNBS組減少，加入LPS和OVA后，CBir1和MCT陽性數較50%乙醇+TNBS組增多(P<0.05),見圖3、表1～3。

4 各組小鼠血清抗-CBir1、MCT和組胺濃度的變化

采用Bonferroni法進行兩兩比較，ELISA結果提示50%乙醇+TNBS模型組中血清MCT、抗-CBir1及組胺的水平明顯高于正常對照組(P<0.05)；將正常對照組與生理鹽水組和50%乙醇組比較，差異無統計學顯著性，因而排除了機械損傷及單獨乙醇的作用對本實驗影響,說明50%乙醇導致的慢性炎癥與灌腸所致腸黏膜機械損傷無關。與50% alcohol+TNBS組相比，50% alcohol+TNBS+ketotifen組血清抗-CBir1、MCT和組胺水平明顯降低，差異有統計學意義，提示酮替芬對TNBS誘導的小鼠結腸炎具有治療作用；50% alcohol+TNBS+LPS+OVA組與50% alcohol+TNBS組相比，上述指標濃度增高，差異有統計學意義，說明LPS和OVA可加重結腸炎的程度，見圖4。

5 血清抗-CBir1濃度與MCT和組胺濃度的相關性分析

根據實驗數據分別繪制血清中上述3個指標的散點圖，結果呈線性趨勢,表明血清中抗-CBir1的濃度與MCT及組胺的濃度相關聯；觀察各組資料均服從正態分布，且各觀察值間相互獨立，可采用Pearson積矩相關系數來描述血清抗-CBir1濃度與上述兩指標之間的關系。結果分別得出血清抗-CBir1與組胺濃度相關系數r=0.751(P<0.01)；血清抗-CBir1與MCT濃度相關系數r=0.648 (P<0.01)。根據統計結果可得出血清中抗-CBir1與MCT的濃度呈正相關關系，小鼠血清中抗-CBir1與組胺的濃度亦呈正相關,見圖5。

討 論

IBD是一種以腹痛、腹瀉及黏液膿血便等為主要臨床表現的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其目前的發病機制尚不明確[11]。50%乙醇+TNBS誘導的鼠結腸炎模型是目前廣泛應用于IBD研究的動物模型[12]。乙醇對腸道黏膜屏障有破壞作用，破壞后的腸黏膜暴露出角蛋白可與TNBS結合形成完全抗原，并通過核轉錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等途徑激發免疫反應[13]。

細菌的鞭毛是細菌主要的運動器官，主要作用包括侵襲、黏附及分泌毒力因子等。細菌鞭毛蛋白對細菌鞭毛的黏附能力、定植以及破壞腸黏膜屏障有重要作用[14]。CBir1是細菌鞭毛蛋白中的一種，具有許多鞭毛蛋白的共性。本實驗結果發現，非模型組小鼠的腸黏膜組織及血清中可檢測到少量的CBir1和抗-CBir1，明顯低于TNBS誘導模型組,表明CBir1參與了小鼠TNBS誘導結腸炎的發病過程。

Figure 3. The expression of CBir1 (A), TLR5 (B) and MCT (C) in mouse colonic epithelial tissue (×400).

圖3小鼠結腸組織中CBir1、TLR5和MCT的表達

TLRs是一類信號轉導通路受體，主要在先天性免疫應答中發揮作用[15]。目前研究表明細菌鞭毛蛋白可以識別TLR5，觸發機體免疫系統[16],兩者結合后，可激活骨髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)轉導途徑，從而促進NF-κB的激活及釋放[17]。激活的NF-κB促進細胞因子的轉錄基因上調，使腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukine，IL)-1β和IL-8等前炎癥細胞因子產生增加，從而參與機體的先天性免疫應答及炎癥反應[18]。上述兩者結合后，亦可促使細胞的caspase-8及Fas相關死亡域蛋白表達上調，促進細胞凋亡的發生[19]。本實驗表明，TNBS誘導模型組小鼠的腸黏膜組織中TLR5的表達量，明顯高于非模型組。表明TLR5參與了小鼠TNBS誘導結腸炎的發病過程。

表1CBir1免疫組化結果
Table 1. Immunohistochemical expression of CBir1 in colonic epithelial tissue of mice in each group (n=12)

Group-++++++Normol control11100Saline1002050% alcohol912050% alcohol+TNBS320750% alcohol+TNBS+ketotifen632150% alcohol+TNBS+LPS+OVA00111

表2TLR5免疫組化結果
Table 2. Immunohistochemical expression of TLR5 in colonic epithelial tissue of mice in each group (n=12)

Group-++++++Normol control10200Saline1021050% alcohol921050% alcohol+TNBS311750% alcohol+TNBS+ketotifen614150% alcohol+TNBS+LPS+OVA00012

表3MCT免疫組化結果
Table 3. Immunohistochemical expression of MCT in colonic epithelial tissue of mice in each group (n=12)

Group-++++++Normol control10200Saline1011050% alcohol930050% alcohol+TNBS401750% alcohol+TNBS+ketotifen523250% alcohol+TNBS+LPS+OVA00111

Figure 4. Comparison of serum MCT, histamine and anti-CBir1 concentrations in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vs50% alcohol+TNBS group.

圖4各組實驗小鼠血清中的MCT、組胺及抗-CBir1濃度比較

Figure 5. The scatter diagram showed the relationship between anti-CBir1 and MCT or histamine levels in each group.

圖5血清抗-CBir1與MCT和組胺濃度關系的散點圖

腸道免疫相關疾病發生時，肥大細胞的數量增加，同時肥大細胞脫顆粒釋放的介質，如組胺、MCT、IL-5和TNF增加[20]。肥大細胞中含有大量的組胺，當肥大細胞被激活時，可釋放組胺促進炎癥反應發生。組胺受體HR1和HR2激活后，可通過影響血管、平滑肌及上皮細胞的功能，參與炎癥反應;同時，組胺是一種高效的促類胰蛋白酶釋放刺激劑。MCT能夠促進炎癥反應發生，其釋放及儲存均有高度的選擇性。因此，MCT是評估肥大細胞激活以及脫顆粒的標志之一。MCT具有刺激外周血T細胞、單核細胞活化，并誘導其釋放IL-6及TNF-α等眾多細胞因子的作用，從而加重炎癥反應。同時肥大細胞釋放的MCT可反作用于肥大細胞，促使更多肥大細胞的激活，形成 “瀑布”效應[21]。本實驗表明，TNBS誘導模型組小鼠的腸黏膜組織中MCT及血清中組胺的表達量，明顯高于非模型組。表明TNBS誘導結腸炎小鼠的發病過程中存在肥大細胞激活。已有研究表明肥大細胞表達TLR5，而TLR5可識別CBir1并啟動炎癥反應[22]。因此我們推測CBir1可通過與TLR5結合而激活肥大細胞。

LPS是構成G-厭氧菌細胞壁的主要成分。研究表明其可與LPS結合蛋白結合形成復合體，并作用于細胞膜上相應的受體，例如Toll樣受體。通過上述途徑將信號轉導至胞內，誘導巨噬細胞及肥大細胞內各種細胞因子的合成及釋放，如IL-10和IL-15等。LPS通過上述途徑可參與腸道的炎癥反應[23-24]。OVA常與LPS使用于誘導腸黏膜的免疫反應，主要通過Toll樣受體等信號轉導過程來促進炎癥反應的發生[25-26]。本實驗中50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組小鼠的DAI評分、HI評分均較50%乙醇+TNBS組明顯升高，因此可見炎癥反應加重。

酮替芬能促進肥大細胞細胞膜穩定的維持，因而減少過敏活性介質的釋放。同時對H1受體具有較強的拮抗作用，因此具有抗組胺作用[27]。從本實驗數據分析顯示50%乙醇+TNBS+酮替芬組小鼠的各項評估指標均較50%乙醇+TNBS組明顯降低，充分表明了酮替芬具有抑制小鼠TNBS結腸炎的作用。

本實驗結果示50%乙醇+TNBS組、50%乙醇+TNBS+酮替芬組和50%乙醇+TNBS+LPS+OVA組疾病嚴重程度的差異存在統計學意義，且加入LPS+OVA組炎癥最重，而TNBS模型組結腸組織中CBir1、TLR5及MCT的表達均與疾病的嚴重程度趨勢一致，嚴重程度越深，表達越高。同時TNBS模型組血清中抗-CBir1、組胺及MCT的表達，亦與疾病的嚴重程度趨勢一致。

采用Pearson積矩相關系數分析得，血清抗-CBir1與MCT濃度呈正相關,血清中組胺的濃度與抗-CBir1的濃度亦呈正相關,說明CBir1的表達量可能與肥大細胞脫顆粒作用相關。結合相關研究報道與本實驗結果，推測CBir1參與肥大細胞的激活過程可能也和TLR5相關。

綜上所述，通過TNBS誘導小鼠結腸炎，可以模擬動物IBD模型。本實驗通過不同的干預措施，模擬不同程度的炎癥反應，即LPS+OVA可加重炎癥過程，酮替芬作為肥大細胞穩定劑，可一定程度減輕炎癥的發生。隨著干預的措施變化，各組小鼠的DAI、HI評分、MCT、CBirl、TLR5及組胺亦呈現出不同程度的表達。CBir1的表達量與肥大細胞脫顆粒作用呈正相關。

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