不同運動強度上調心肌祖細胞標志物表達誘導心臟細胞增殖

周云鶴，費 儉，楊 樺，秦黎黎，孫靜瑜，李 青

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不同運動強度上調心肌祖細胞標志物表達誘導心臟細胞增殖

周云鶴1，費 儉1，楊 樺1，秦黎黎1，孫靜瑜1，李 青2

1. 同濟大學, 上海 200092; 2. 復旦大學 腦科學研究院, 上海 200433

目的：探討不同運動強度對成體小鼠心肌祖細胞標志物Isl1基因表達的影響及誘導心臟細胞增殖的作用。方法：雄性C57BL/6J小鼠隨機分為安靜對照組（C）、有氧運動組（A）和過度運動組（E），每組6只。A組和E組分別采用小動物跑臺方式進行為期4周不同強度的訓練。訓練結束后采用超聲心動圖方法對心臟各層結構界面和心功能做定性定量觀察與分析，Real-Time PCR法檢測心肌Isl1基因和增殖因子PCNA表達，血常規和血清生化檢測分析CK和CK-MB等心肌酶譜表達，HE染色觀察分析心肌細胞形態結構。結果：運動誘導心肌祖細胞標志物基因Isl1表達上調，且促進細胞增殖因子PCNA的表達上調；有氧運動比過度運動的效果更顯著；超聲心動圖結果顯示，有氧運動可以顯著改善心功能，提高心系數。結論：運動可有效提高小鼠心臟內源性心肌祖細胞標志物Isl1表達，促進細胞增殖因子PCNA表達增加，改善心臟功能。其中，有氧運動比過度運動對心臟形態和功能改善更顯著。探索不同運動強度對心臟細胞再生的影響，將有助于驗證或補充成體心肌祖細胞自我更新和分化的生物學機制，為運動醫學、運動康復學和預防醫學提供有價值的實踐依據。

心肌祖細胞；Isl1；超聲心動圖；運動強度；細胞增殖

成體心肌組織的更新和分化研究成為近年來關注的熱點[14]。心肌細胞增殖可作為心臟損傷后修復再生的基礎，對于治療心肌損傷后心肌細胞損失及再生不足等導致的心功能不全、心律失常和心臟衰竭等嚴重心臟疾病具有重要意義。

心臟干/祖細胞（cardiac stem cells, CSCs/cardiac progenitor cells, CPCs）療法是心肌損傷修復的重點治療策略。其中，非創傷性的促進內源性干細胞再生[11,17]不僅可以提供一種非侵入性的治療，而且能夠規避移植引起的免疫抑制，正越來越受到重視。促進成體心臟心肌干/祖細胞的更新和分化，以及有效動員足量的干/祖細胞歸巢，修復受損心肌組織，是目前生物學、臨床醫學和康復醫學共同關注的重要課題。CPCs標記物是心肌祖細胞分類的標志，能夠作為祖細胞因子受體，通過改變微環境對細胞遷移、定植和分化等起到調節作用。至今研究者已發現多種類型不同標記的心肌祖細胞，主要包括C-kit、Sca-1、Nkx 2.5、Flk1、GATA4 和Isll等[9,10,12,20]。這些心肌祖細胞具有不同的表型特征和分化潛能，但是各類型心肌祖細胞的分化潛能尚未得到充分證實。

在眾多心肌干/祖細胞的熱點標志物研究中，IsI1已被證明是胚胎心臟組織干細胞的標志物[18]，Isl1陽性細胞是胚胎心臟發育中重要的原始祖細胞，利用譜系追蹤技術對Isl1陽性細胞分化研究顯示，其能夠分化為血管內皮、心內膜、平滑肌、右室及左房肌等全部心臟細胞譜系[19,25]。

課題組前期研究發現，有氧運動誘導的心肌肥大是一個平衡的和可逆的生理性增長過程[6]，許多因子參與了細胞增殖的調控，Isl1參與心肌肥大與增殖調節。此外，Isl1陽性細胞在胚胎發育期、出生后直到成年都存在[15]，是目前心臟中發現的唯一一類能用單一標記進行識別的祖細胞，因此，Isl1陽性細胞是用于研究心臟再生的最佳潛在性內源祖細胞。綜上所述，Isl1陽性細胞具有成為運動誘導心肌細胞增殖的內源性心肌祖細胞來源的可能性。但是運動能否誘導Isl1陽性細胞自我更新與分化目前未見報道。

本研究選擇心肌祖細胞標志物基因Isl1作為主要研究對象，選用野生型雄性C57BL/6J小鼠，采用小動物跑臺的運動方式，不同的運動負荷干預，通過超聲心動圖、體重、心系數、血液生化檢測、細胞增殖因子和轉錄因子檢測以及HE染色等多種方式，研究不同運動強度對小鼠心臟結構和功能的影響，探索有氧運動和超負荷運動對成年小鼠心臟心肌細胞增殖的作用機制，研究結果將有助于驗證或補充成體心肌祖細胞自我更新和分化的影響及生物學機制。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象及分組

雄性野生型C57BL/6J小鼠由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。運動模型建立及動物飼養在同濟大學動物房?；\內鋪蓋滅菌的木屑墊料，每隔12 h光暗循環，每日小鼠自由進食，標準鼠糧及飲水均經過輻照殺毒或高溫高壓滅菌處理。動物福利及實驗操作嚴格遵守《實驗動物管理條例》進行。動物實驗內容和方案獲得上海南方模式生物研究中心實驗動物看護及使用倫理委員會的批準（SRCMO-IACUC NO. 20140002）。

1.2 實驗儀器與試劑

主要儀器：運動干預采用JD-PT小動物實驗跑臺，超聲心動圖數據使用Visual Sonics770型小動物超聲儀采集，組織切片采用Thermo Shandon全自動組織石蠟包埋機進行切片，用90iNikon光學顯微鏡進行觀察，采用MP Biomedicals Fast Prep-24勻漿系統、Beckman Coulter（Microfuge 22R）冷凍離心機和CFX96 Real-Time System PCR儀進行基因表達測試，使用Sysmex CHEMIX-180全自動生化分析儀進行血生化測試等。

主要試劑：異氟醚、多聚甲醛和戊巴比妥鈉購于Sigma公司，蘇木素/伊紅染液購于珠海貝索生物技術有限公司，6×Loading Buffer（核酸專用）和限制性內切酶購自TaKaRa有限公司，PCR試劑盒購自天根公司，Trizol購自Roche公司；DEPC水購自上海生工，瓊脂糖Regular Agarose G-10購自BioWest，蛋白酶K購自Merck Millipore 公司，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution, PBS）購于碧云天生物技術研究所等。

1.3 實驗設計與運動方案

實驗干預為28天，運動強度參照Bedford訓練模型標準[8]并進行適當修改。將雄性野生型C57BL/6J小鼠隨機分成3組：安靜對照組（C）、有氧運動組（A）和過度運動組（E），每組6只。C組正常飲食，不干預，籠內自由活動。A組和E組在電動鼠類跑臺上進行適應性訓練1周，每周5次，每次訓練20 min，速度為10 m/min，旨在使其熟悉跑臺運動方式。

正式跑臺訓練4周。有氧運動組：速度15 m/min，坡度0°，60 min/天，每日下午4∶00-5∶00進行訓練，每周訓練6天，間隔1天，周日休息。超負荷運動組：速度25～35 m/min，逐漸遞增，坡度10°～15°逐漸遞增，時間90 min/天至120 min/天，逐漸遞增。每日下午4∶00-6∶00進行訓練，每周訓練6天，間隔1天，周日休息。

超負荷運動標準：動物不能堅持本級負荷跑速，先后滯于跑道后1/3處達6次以上，聲光電力刺激驅趕無效。

1.4 測試指標與方法

1.4.1 超聲心動圖檢測

超聲心動圖是應用超聲波回聲探查心臟和大血管以獲取有關信息，將心臟各層結構界面活動情況的空間和時間變化以影像或曲線形式記錄下來的一組無創性檢查方法。超聲心動圖可對心臟解剖和心功能做出定性診斷和定量分析。本研究超聲心動圖檢測評價運動小鼠左心室功能具體步驟如下：

1. 運動訓練結束后24 h，小鼠異氟醚吸入麻醉。

2. 小鼠麻醉穩定后固定，心前區脫毛，取仰臥位。

3. 超聲心動圖檢測使用Visual Sonics Vevo 770高分辨率小動物超聲系統，可對小鼠多臟器的兩維超聲圖像采集，心臟M型超聲檢測，解剖型心動周期重建，心功能分析檢測等。配有氣體麻醉系統，使小鼠的麻醉趨于持續性，小鼠的心率保持穩定性，在進行超聲過程中使其處于正常的生理狀態；數字射頻輸出模塊，能記錄心肌運動、血管張力等變化。寬頻探頭（RMVTM707B），頻率30 MHz，聚焦深度1.3 cm，在小鼠胸骨左緣、胸骨右緣、心尖部及胸骨上窩掃查。

采集小鼠心臟的二維、M型超聲心動圖像和脈沖多普勒檢測血流頻譜，并進行心臟結構、各瓣口血流及時間參數的測量，測量評價心臟結構和功能的各項參數。

3組小鼠，每組6只，每只小鼠在每個切面上檢測2次，每次讀取連續5個心動周期數值，取平均值用于統計。

4. 記錄左室收縮期末徑（Left Ventricular Internal Diameter at end systole，LVIDs）、左室舒張期末徑（Left Ventricular Internal Diameter at end diastole，LVIDd），室間隔收縮末期厚度（Interventricular Septal Thickness at systole，IVSs），室間隔舒張末期厚度（Interventricular Septal Thickness at diastole，IVSd），收縮末左室后壁厚度（Left Ventricular Posterior Wall at systole，LVPWs），舒張末左室后壁厚度（Left Ventricular Posterior Wall at diastole，LVPWd）。

由超聲心動圖程序自動計算左室射血分數（Left Ventricular Ejection Fraction, LVEF）、左室短軸縮短率（Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS）。

5. 超聲醫師操作前未知悉小鼠分組情況，在操作時盡量避免對小鼠胸廓施壓，以免影響心率和測量數據。

1.4.2 血清生化檢測

本實驗血清生化檢測指標主要選取心肌酶譜：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同功酶（CK-MB）和天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）等指標變化進行小鼠運動機能的評定。本實驗血清檢測樣本取材：1.5 ml EP管收集小鼠全血，收集后立刻放入4℃冰箱中。所有樣本取好后離心，3 000 rpm×10 min，取上清，用于生化指標檢測。

1.4.3 實時定量PCR檢測增殖因子和心肌祖細胞標志物表達

提取3組小鼠心臟組織總RNA、反轉cDNA、Real time PCR法檢測細胞增殖因子和轉錄因子在心臟組織的表達情況。每組取3只小鼠的心臟組織RNA、反轉錄成cDNA進行實時定量PCR檢測。

表1 Real time PCR法檢測的引物序列表

擴增條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V，20 min）。

1.4.4 HE染色組織檢測

心臟組織樣本（3組小鼠，每組3只）4%PFA固定24 h后，轉移至組織夾中，流水沖洗5～10 min，以去除殘余的多聚甲醛。使用Thermo Shando全自動組織處理機完成組織塊的脫水、浸蠟等過程。步驟：1）脫蠟：切片經60℃烘干30 min后，二甲苯脫蠟2次，每次浸泡15 min；2）水化：梯度乙醇處理，依次經100%、100%、95%、75%、50%乙醇、去離子水浸泡，每步5 min；3）蘇木素染色：蘇木素染液浸泡2 min，流水沖洗至切片顏色穩定；4）分色（可選）：如蘇木素染色過深，可用1%鹽酸酒精進行分色，時間1～2 s，完成后用流水沖洗，直至核返藍；5）伊紅染色：伊紅染液浸泡2 min，自來水沖洗5 min至切片顏色穩定；6）脫色：如伊紅染色過深，可用95%乙醇適度浸泡脫色，時間1～2 s；7）脫水：梯度乙醇處理，依次經50%、75%、95%、100%、100%乙醇浸泡，每步5 min；8）透明：二甲苯浸泡2次，每次10 min；9）封片：切片自二甲苯取出，待稍微晾干后用中性樹膠封片，并于通風櫥中吹干2～3 h。

1.5 數據統計

所有數據以均數±標準誤（±）表示。數據組間比較采用方差分析（one way or two-way ANOVA，Bonferroni post hoc analysis）和Studengt’s t-test方法。當＜0.05時表示差異具有統計學意義。數據統計及繪制圖表使用軟件Graph Pad Prism 5.0完成。

2 研究結果

2.1 不同運動強度對小鼠心功能的影響

采集小鼠心臟的二維、M型超聲心動圖像和脈沖多普勒檢測血流頻譜，測量評價心臟結構和功能的各項參數。3組小鼠的超聲心動圖片如圖1所示：E組小鼠的M型超聲心動圖顯示二尖瓣前葉活動曲線CD段出現一個向上突起的異常波形（即SAM征），致使左室流出道內徑變窄，室間隔肥厚，左室內徑減小。

圖1 小鼠不同強度運動4周的超聲心動圖

Figure 1. Echocardiography of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks

射血分數（EF）的值（圖2A），A組明顯升高，與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

左室短軸縮短率（FS）結果（圖2B）：A組明顯升高，與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

收縮末左室后壁厚度（LVPWs）結果：A組明顯升高（圖2C），與C組相比有非常顯著性差異（＜0.001），E組與C組相比有顯著性差異（=0.026）。

室間隔收縮末厚度（IVSS）結果：A組明顯升高（圖2D），與C組相比有顯著性差異（=0.034），E組與C組相比沒有顯著性差異。

左室收縮末期內徑（LVIDs）結果：A組明顯降低（圖2E），與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

左室舒張末期內徑（LVIDd）結果（圖2F）：A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.002），E組與C組相比沒有顯著性差異。

注：A：射血分數（EF），B：左室短軸縮短率（FS），C：收縮末左室后壁厚度（LVPWs），D：室間隔收縮末厚度（IVSS），E：左室收縮末期內徑（LVIDs），F左室舒張末期內徑（LVIDd）。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，圖3、圖4同。

Figure 2. Hyperdata Results of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks

2.2 心系數結果

心系數為心臟重量與體重的比值，是反映心肌肥大的重要指標。一般認為，運動性肥大是心臟對運動訓練的適應性反應，是一種生理性心臟重塑的過程。本實驗結果顯示，4周有氧運動后小鼠心臟重量及心系數增加，與C組相比具有顯著性差異（表2），表明有氧運動誘導了心臟肥大的形成。而E組小鼠心臟重量及心系數變化不大，與C組相比沒有統計學意義上的顯著性差異。

表2 運動4周后小鼠體重、心臟重量及心系數變化

注：***表示＜0.001。

2.3 心肌酶譜指標結果

運動4周后，小鼠心肌酶譜指標檢測結果（圖3）：肌酸激酶（CK）結果，A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.014），E組顯著升高，與C組相比有顯著性差異（=0.035）。肌酸激酶同功酶（CK-MB）結果，A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.005），E組顯著升高，與C組相比有顯著性差異（=0.017）。天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）結果，A組明顯降低，與C組相比有顯著性差異（=0.016），E組與C組相比沒有顯著性差異。

圖3 不同強度運動4周小鼠的心肌酶譜結果

Figure 3. CK , CK-MB and AST Results of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks

2.4 實時定量PCR檢測增殖因子和心肌祖細胞標志物結果

Real-time PCR 法檢測增殖因子PCNA和心肌祖細胞標志物Isl1在心臟組織表達情況，增殖因子PCNA結果（圖4A）：A組明顯升高，與C組相比有顯著性差異（＜0.0001），E組與A組相比升高，有顯著性差異（=0.003）；心肌祖細胞標志物Isl1結果如圖4B所示，Isl1在A組和E組都有增加，其中，A組與C組相比有顯著性差異（=0.004），E組與C組相比有顯著性差異（=0.035）。

圖4 增殖因子和心肌祖細胞標志物的表達結果

Figure 4. Expression of Growth Factor and Myocardial Progenitor Cell Markers

2.5 HE組織染色結果

心肌組織HE染色觀察：HE染色顯示，C組小鼠心肌纖維結構清晰，著色均勻，細胞核大小均勻，位于心肌纖維的中央，未見肌絲斷裂（圖5 Control）；E組小鼠心肌纖維數量減少，心肌橫截面空白區域明顯多于C組，可見肌纖維斷裂，但未見變性及壞死改變（圖5 Excessive）；A組小鼠心肌纖維結構清晰，可見肌細胞增粗，細胞境界清楚，心肌橫截面空白區域少于超負荷運動組，肌絲斷裂較少見（圖5 Aerobic），但細胞未見變性和壞死等改變。

圖5 小鼠不同強度運動4周的心臟HE染色結果（X40）

Figure 5. Cardiac HE Staining rResults of Mice at Different Exercise Intensity for 4 Weeks（X40）

3 分析與討論

LIM同源結構域轉錄因子1（insulin transcription factor1, Isl1）基因也被稱為胰島素增強子結合蛋白1（islet-1，Isl1），屬于LIM同源框基因家族，是1990年瑞典的Karlsson等[16]在研究胰島素基因表達調控過程中，從大鼠胰島素瘤細胞系RIN的cDNA文庫中首次發現，并被克隆測序。Isl1是一種多效性轉錄因子，可以作用于不同的下游靶基因，在許多組織和器官的發育進化過程中，如心臟和胰腺的器官形成、運動神經元的分化等[18,21,26]，發揮重要的作用，包括影響細胞的增殖、分化和遷移等。

Isl1最近幾年被發現在心臟發育過程中起重要作用。研究表明，Isl1基因敲除小鼠心血管發育不全，在E9.5心臟發育停滯，并在E10.5死亡[12,28]。Isl1在特異的心肌前體細胞中表達，并隨著心臟的發育表達量逐漸下降。Isl1在早期發育過程中的正常表達，對心肌前體細胞的增殖、遷移和存活是必需的[25]。同時有研究發現，Isl1可以協同多個基因共同調控心臟發育，進而影響整個心臟發育的過程，如Isl1與Gata4及Nkx2.5能夠共同協調發揮作用[7,13,29-31]。Isl1和有關基因在心臟發育過程中表達異常會導致各種先天性心臟病的出現[2,24,34]。

Isl1陽性細胞被認為是內源性心肌祖細胞，可以分化生成心臟發育所需約2/3的細胞，即可以分化成心肌細胞系、內皮細胞系和平滑肌細胞系[18]，以及所有心血管隔室和傳導系統的主要細胞類型[23]。本研究表明，適宜規律的運動能夠降低實驗動物體重，增加心臟重量，增大心肌細胞直徑和細胞體積等形態學指標，提高心系數和左室短軸縮短率等心功能指標，與以往研究報道的運動模型相符[1,3,22]。本研究選用的C57小鼠心臟結構和功能的生長發育變化主要發生在4周齡以前，4周齡以后心臟的生長發育趨于成熟。因此可以表明，適宜的規律性運動有助于成年小鼠心臟功能的提高和心系數的增加，引起運動型心臟肥大。

心肌生理性肥大和病理性肥大的早期形態學非常相似，都表現為室壁增厚和質量增加，解剖學水平上很難區分。細胞水平上，都表現出心肌細胞體積增大、直徑增寬和肌節增加。病理性心肌細胞肥大是心臟對抗血流動力學增加、肌損傷和神經激素應激等的共同反應。受損的心臟，肥厚機制被激活，心肌細胞生長，成纖維細胞增殖和細胞外基質沉積，相應的心室壁增厚，左室重量增加，心肌纖維化及心臟舒張功能降低[32,33]。從長遠來看，可導致嚴重的收縮和舒張功能障礙，導致失代償性充血性或纖維化心臟衰竭。

截止目前，關于運動性心肌肥大機制的研究，主要集中于心肌實質成分與間質成分的形態學、生理學與分子生物學等方面，對心肌細胞的發育生物學和細胞生物學領域的研究報道尚少[27]。關于運動促進心肌干細胞的動員、增殖和分化的報道少見。

本研究結果顯示，有氧運動組和超負荷運動組野生型小鼠心臟增殖因子PCNA都增加，具有顯著性差異（＜0.000 1和=0.003），表明不同運動強度對心肌細胞周期產生影響，引起的心肌肥大伴隨著增殖的發生。

心肌祖細胞標志物Isl1的表達，與對照組相比，有氧運動組和超負荷運動組野生型小鼠心臟Isl1表達量都升高，具有顯著性差異（=0.004和=0.035），表明不同運動強度促進了小鼠心肌祖細胞標志物表達的提高。

本研究結果顯示，運動能夠促進野生型小鼠心肌祖細胞標志物Isl1的提高，增強細胞增殖因子PCNA的表達，但是運動是否促進了Isl1+細胞的增殖，或者運動促進細胞增殖的細胞來源是否為Isl1+細胞？目前尚不能明確，后續需要進行譜系示蹤研究來確定適宜的運動促進心臟細胞增殖的來源。

本研究體現了發育生物學、心臟醫學和運動人體科學等多學科交叉融合的科學發展思想，研究結果將有助于驗證或補充成體心肌祖細胞自我更新和分化的影響及機制。

4 結論

運動誘導成體野生型小鼠心臟Isl1基因表達上調，且促進心臟細胞增殖因子PCNA的表達上調，有氧運動比超負荷運動的效果更顯著。超聲心動圖結果顯示，有氧運動可以顯著改善心功能，提高心系數。

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Different Exercise Intensity Up-regulate Marker of Cardiac Progenitor Cells and Induce Cell Proliferation in Adult Heart

ZHOU Yun-he1, FEI Jian1, YANG Hua1, QIN Li-li1, SUN Jing-yu1, Li Qing2

1. Tongji University, Shanghai 200092, China; 2. Fudan University, Shanghai 200433, China.

Objectives: The aim of this study is to dissect the function of marker of cardiac progenitor cells (Isl1) in cardiac cell proliferation in adult mammals under different exercise Intensity.Methods:2-month old adult male C57BL/6J mice were randomly divided into 3 groups(n=6): control(C), aerobic training(A) and excessive exercise (E).Mice in A and E were underwent 4-week’s training program using small animal treadmill with gradually increasing intensity.Heart function was evaluated by small animal echocardiography. Marker of Cardiac Progenitor Cells (Isl1) and Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were observed and analyzed by Real Time PCR. Myocardium was observed hematoxylin-eosin staining. Myocardial enzymes were measured by blood biochemical tests.Results: Exercise resulted in the up-regulation of gene expression both for Marker of Cardiac Progenitor Cells (Isl1) and cell proliferation factor (PCNA). Different exercise intensity could increase the expression of cardiac progenitor cell marker. The effect of aerobic training was more significant than overload exercise. The results of echocardiography show that aerobic exercise can significantly improve cardiac function and heart coefficient. Conclusions: Exercise can effectively stimulate the mouse heart, increase the expression of endogenous marker of cardiac progenitor cells(Isl1), promote the expression of Proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and improve heart function. The effect of aerobic training was more significant than excessive exercise for the heart shape and function improvement. Exploring the effects of different exercise intensity on cardiac cell regeneration will help to validate or supplement the influences and mechanisms of cell proliferation and differentiation of adult cardiac progenitor cells, and provide valuable practical basis for sports medicine, sports rehabilitation and preventive medicine.

G804.5

A

1000-677X(2018)06-0053-07

10.16469/j.css.201806006

2018-01-08；

2018-06-10

國家自然科學基金資助項目(31401019)。

周云鶴,女,博士,講師,主要研究方向為運動與干細胞,E-mail:maggie211@#edu.cn; 費儉,男,教授,博士研究生導師,主要研究方向為組織干細胞與模式生物,E-mail:Jfei@#edu.cn。