LC-MS/MS法測定Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽及其代謝產物ET-acid

劉美玲， 陳星宇， 趙志玲， 張文勝， 徐小平， 錢廣生

(1. 四川大學華西藥學院，四川 成都 610041; 2. 四川大學華西醫院 轉化科學中心麻醉與危重急救研究室，四川 成都 610041)

0 引 言

ET-26鹽酸鹽是短效麻醉藥物依托咪酯(Etomidate )的新類似物，它是由依托咪酯經過水解，酯化而形成的活性咪唑類衍生物[1]。ET-26鹽酸鹽與依托咪酯有類似的藥理特點，具有全身麻醉和鎮靜作用，且起效快、蘇醒迅速，對心血管的穩定性好[2]，還很大程度上克服了依托咪酯的腎上腺素抑制作用[3]。目前對于生物樣品中ET-26鹽酸鹽的含量檢測方法報道較少，有文獻報道用容量法[4]對ET-26鹽酸鹽進行檢測，該方法雖簡便，但是靈敏度較低，不適合用于生物樣品的檢測。也有文章使用GC-MS[5]對ET-26鹽酸鹽進行檢測，ET-26鹽酸鹽在制備過程中易產生有關物質依托咪酯酸及依托咪酯，影響ET-26鹽酸鹽的分離測定，該方法未能對其雜質依托咪酯酸進行分離檢測，且方法靈敏度低，難以滿足臨床上個體血藥濃度監測的需求。楊姍姍等[1]用HPLC方法成功分離了依托咪酯酸、依托咪酯及ET-26鹽酸鹽，也為本研究分離依托咪酯酸和ET-26鹽酸鹽提供了參考。依托咪酯的檢測方法主要有高效液相色譜法[6-8]、氣相色譜法[9-10]、氣質聯用[11-12]等。由于ET-26鹽酸鹽與依托咪酯結構相似，可參考測定生物樣品中的依托咪酯的方法?？紤]到生物樣本中血藥濃度低，且樣本成分復雜，僅用高效液相色譜法難以達到生物樣本中檢測靈敏度和專屬性的要求，本課題擬采用具有高靈敏度和高選擇性的液相-質譜聯用法測定血漿中ET-26鹽酸鹽的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與實驗動物

Agilent 1200 高效液相色譜儀；Agilent G6460型三重四級桿質譜儀（Agilent Mass-Hunter工作站）；Beckman P/ACE MDQ儀（Beckman 32 Karat工作站，Beckman Coulter公司）；十萬分之一電子分析天平（Sartorious ME215s，Sartorious CPA225D）；pH計（METTLER-TOLEDO，320pH meter，Metter-Toledo儀器上海有限公司）；漩渦混勻儀（IKA MS3 basic）；MILLI-Q超純水純化儀；CHMEDA Excel 210SE型麻醉機（美國CHMEDA公司）：PHILIPS 150B3監護儀（蘇州飛利浦消費電子有限公司）；BL-420E+型生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）。

氨水、乙酸、甲酸、無水乙醇、甲醇、乙腈均為色譜純。ET-26鹽酸鹽對照品（20140218，含量99.57%），實驗室精制；依托咪酯酸對照品（20140211批，含量91.40%），實驗室自制；依托咪酯（101131-201001），依托咪酯雜質C{1-methylethyl 1-[(1RS)-1-phenylethyl]-1H-imidazole-5-carboxylate}，均購自中國藥品生物制品檢定所。

成年健康Beagle犬9只，體重7～10 kg（由四川省醫科院實驗動物研究所提供）。

1.2 對照品儲備液與內標溶液的配制

精密稱取ET-26鹽酸鹽對照品、依托咪酯酸對照品各10 mg，至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別作為對照品儲備液，4 ℃保存備用。取依托咪酯雜質C（內標）11 mg，至50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為內標儲備液，4 ℃保存備用。內標儲備液臨用前用乙腈稀釋至11 ng/mL，作為內標溶液。

1.3 血漿樣品的預處理

取血漿樣品100 μL置于1.5 mL EP管中，加入含乙腈的內標溶液400 μL，渦旋混勻2 min(2 500 r/min) ，離心20 000g× 10 min，取上清液100 μL于1.5 mL EP管中，加入等體積的無水乙醇，渦旋混勻2 min (2 500 r/min)， 取上清液5 μL進樣分析。

1.4 色譜條件

分析柱：Agilent Extend-C18 (3.0 mm × 100 mm，3.5 μm)；流動相：水（0.01% NH3，用乙酸調pH至9.0）-乙腈，體積比 35:65；流量：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣盤溫度：10 ℃；洗針液體：乙醇-水（體積比 3:1），洗針10 s；進樣體積：5 μL；進樣溶液：乙腈-乙醇（體積比 1:1）。

1.5 質譜條件

離子源：ESI 源；霧化氣和輔助氣 ：氮氣；離子源溫度：300 ℃；氣體流量：5 L/min；噴霧器壓力：45 psi（1 psi = 6.895 kPa）；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：11 L/min；毛細管電壓：3500 V；輔助電壓：500 V；掃描方式：多反應監測(MRM) ，正離子模式；用于定量分析的檢測離子對為：ET-26鹽酸鹽，m/z275.3/105.1； 依托咪酯酸，m/z217.0/113.1；依托咪酯雜質C（內標），m/z259.0/155.1。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇及優化

2.1.1 沉淀劑的選擇

本實驗篩選了甲醇、乙腈、乙醇作為沉淀劑，通過依托咪酯酸的峰面積，考察沉淀效果。其中乙腈沉淀蛋白效果最好，甲醇和乙醇沉淀蛋白絮狀物較多，考慮到進樣溶劑為乙腈-乙醇（1:1），故進一步考察了乙腈:乙醇體積比1:1，4:1，9:1為沉淀劑的沉淀效果，結果顯示單獨以乙腈為沉淀劑，效果最好。

2.1.2 沉淀劑體積的選擇

通過依托咪酯酸的峰面積，考察乙腈與血漿體積比分別為1:2，1:3，1:4時蛋白的沉淀效果。結果表明，血漿:乙腈（1:4）沉淀最干凈，且峰面積響應值最大，故以此為蛋白沉淀劑。

2.2 色譜條件的選擇及優化

2.2.1 流動相的選擇

對于+ESI離子源，流動相一般采用10 mmol/L的甲酸或者乙酸溶液，但實驗發現采用甲酸或者乙酸等偏酸性溶液會使得ET-26鹽酸鹽部分解離，存在分子型和離子型兩種形式[13]，導致基線不穩，從而影響測定結果。結合本品色譜條件在偏堿性條件下分離效果較好，考察了0.01% NH3（乙酸調節pH至8.0，9.0，10.0）為流動相A，乙腈為流動相B時，基線的漂移情況。結果發現流動相改為堿性后ET-26鹽酸鹽不會解離，且基線平穩。同時，流動相B的pH為9.0時，峰形較好。流動相體積比A:B =35:65時，各色譜峰分離較好，且出峰時間合適。

2.2.2 進樣溶液的選擇

分別考察乙腈、甲醇、乙醇、乙腈-水(1:1)、乙腈-甲醇(1:1)、乙腈-乙醇(1:1)為進樣溶液時，各色譜峰的峰形以及分離情況。結果表明，以乙腈為進樣溶液時，由于溶劑與初始流動相極性差異較大，依托咪酯酸容易分裂成兩個峰，以甲醇，乙醇為進樣溶液時，依托咪酯酸的響應值較小。乙腈與乙醇的混合溶液為進樣溶液時峰面積響應最大，且峰形較好。

進一步考察了乙腈與乙醇不同混合比例對依托咪酯酸峰面積響應值的影響，結果表明乙腈-乙醇(1:1)為進樣溶液時，依托咪酯酸響應值及峰形最好，因此將其作為最終進樣溶液。

2.3 質譜條件的選擇及優化

2.3.1 ET-26鹽酸鹽定量離子對的選擇

在+ESI離子化方式下，進行ET-26鹽酸鹽的母離子掃描（Q1 scan），產生準分子離子[M+H]+峰：m/z275.3，在子離子掃描（product ion scan）模式下掃描子離子，選取豐度最高、信號最強的子離子：m/z171.1作為定量離子對。但實驗發現若采用這一豐度最大的離子對進行定量，ET-26鹽酸鹽極易在色譜柱上殘留，而其豐度值稍小的離子對m/z275.3/105.1也能達到相應的響應要求且不易在色譜柱上殘留，故最終選擇了m/z275.3/105.1為MRM定量的離子對。采用Agilent G6460型三重四級桿質譜儀自帶的Agilent Optimizer工作站自動優化功能優化所有質譜參數以獲得較高的靈敏度。

2.3.2 依托咪酯酸定量離子對的選擇

實驗采用流動相：水（0.01% NH3，用乙酸調pH至9.0）-乙腈（35:65），對依托咪酯酸進行母離子掃描（Q1 scan），產生準分子離子[M+H]+峰：m/z217.0，然后在子離子掃描（product ion scan）模式下掃描子離子，選取豐度最高、信號最強的子離子：m/z113.1，采用Agilent G6460型三重四級桿質譜儀自帶的Agilent Optimizer工作站自動優化功能優化所有質譜參數以獲得較高的靈敏度。

2.3.3 內標的選擇

生物樣品測定中，由于前處理步驟較多，容易引入較大的誤差，因此引入內標十分必要。本實驗選擇的內標有英國藥典上的依托咪酯、美托咪酯（依托咪酯雜質B）、依托咪酯雜質C。其結構均與待測物ET-26鹽酸鹽及其代謝產物依托咪酯酸（依托咪酯雜質A）結構類似。依托咪酯的總離子流色譜圖（m/z245.0/141.0，碎裂電壓80 V，碰撞能量4 eV）的保留時間tR為16.5 min，相較于待測物ET-26鹽酸鹽的保留時間tR更長，延長了分析時間。實驗發現，美托咪酯在24h內不能在樣品中穩定存在，容易分解。而依托咪酯雜質C與待測物ET-26鹽酸鹽可以完全分離，出峰時間較快，且其在10 ℃條件下可以穩定保存24 h，因此最終選擇依托咪酯雜質C作為內標。對其進行優化后最優定量離子對為m/z259.0/155.1。

2.4 特異性實驗

平行取來自6個不同個體的正常Beagle犬空白血漿，均同時加入ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸及依托咪酯雜質C，按照1.3項下方法處理。另取Beagle犬靜脈注射定量ET-26鹽酸鹽10 min后所得血漿樣品，按照1.3項下方法處理，在選定的色譜條件測定，結果如圖1～圖3所示，血漿中內源性物質對待測物及內標的測定無干擾。

2.5 標準曲線，線性范圍與定量限、檢測限

圖1 空白血漿處理后依托咪酯酸、ET-26鹽酸鹽、內標總離子流色譜圖

圖2 空白血漿加依托咪酯酸、ET-26鹽酸鹽，依托咪酯雜質C處理后總離子流色譜圖

圖3 Beagle犬靜脈注射定量ET-26鹽酸鹽10 min后所得血漿樣品處理后總離子流色譜圖

取正常Beagle犬空白血漿80 μL各8份，分別加入質量濃度為20 900，10 450，3 483，1 161，387.0，129.0，64.51，32.25 ng/mL的ET-26鹽酸鹽標準溶液10 μL，質量濃度為21 080，10 540，3 513，1 171，390.4 ，130.1 ，65.06，32.53 ng/mL的依托咪酯酸標準溶液10 μL，分別按1.3項處理，并按優化的色譜質譜方法檢測。以血漿濃度為橫坐標，標準溶液與內標的峰面積之比為縱坐標作圖，結果表明ET-26鹽酸鹽，依托咪酯酸分別在3.225～2 090 ng/mL和3.253～2 108 ng/mL范圍內線性良好，其線性回歸方程分別為y= 0.008 13x- 0.005 64 (r= 0.999 8)，y= 0.005 1x+ 0.026 55 (r= 0.999 8)。取主峰峰高約為基線噪聲的10倍（S/N= 10）作為定量限，ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸定量限分別為3.225 ng/mL、3.253 ng/mL。取主峰峰高約為基線噪聲的3倍（S/N= 3）作為檢測限，ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸的檢測限分別為0.970 0 ng/mL、1.000 ng/mL。

2.6 回收率考察

取9份正常Beagle犬空白血漿80 μL，分別加入低中高3個濃度的ET-26鹽酸鹽標準溶液（129.0，1 161，10 450 ng/mL）和依托咪酯酸標準溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，設3個平行。同時取9份同等體積的乙腈溶液80 μL，加樣情況同上。按照1.3 項下血漿樣品的預處理方法處理，以空白加標血漿中待測物與內標的比值Ai除以乙腈溶液中待測物與內標的比值As，其結果作為回收率考察。結果表明 Beagle 犬血漿中ET-26鹽酸鹽低，中，高濃度回收率分別為86.57% ± 3.3%，90.25% ± 0.57%，105.03% ± 0.90%；依托咪酯酸的低，中，高濃度回收率分別為96.54% ± 1.4%，95.94% ± 0.87%，98.27% ± 0.53%，結果表明該方法回收率高。

2.7 基質效應

取9份正常Beagle犬空白血漿80 μL，分別置于1.5 mL EP管中，加空白乙腈溶液400 μL，渦旋混勻2 min(2 500 r/min) ，離心20 000g× 10 min ，取上清液置于1.5 mL EP管中，氮氣吹干，加入含乙腈的內標溶液400 μL復溶，再加入80 μL純乙腈。分別加入低中高3個濃度的ET-26鹽酸鹽標準溶液（129.0，1 161，10 450 ng/mL）和依托咪酯酸標準溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，作為A組，設3個平行。

同時取9份同等體積的乙腈溶液80 μL置于1.5 mL EP管中，加入含乙腈的內標溶液400 μL，分別加入低中高3個濃度的ET-26鹽酸鹽標準溶液（129.0，1 161，10 450 ng/mL）和依托咪酯酸標準溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，作為B組，設3個平行。兩組樣品均按照1.3項下樣品的預處理方法，取上清液5 μL 進樣分析。測得ET-26鹽酸鹽的低、中、高3種濃度的基質效應分別是88.13% ± 4.2%，89.21% ± 2.5%，91.42% ± 2.6%；依托咪酯酸的低、中、高3種濃度的基質效應分別是86.10% ± 5.3%，88.52% ± 3.5%，90.35% ± 2.5%，結果表明基質效應不影響實驗結果測定。

2.8 日內、日間精密度

取18份正常Beagle犬空白血漿80 μL，分別加入低中高3個濃度的ET-26鹽酸鹽標準溶液（129.0 ，1 161，10 450 ng/mL）、依托咪酯酸標準溶液（130.1，1 171，10 540 ng/mL）各10 μL，每種濃度的樣品各6份。連續3 d制備樣品，測定3批樣品精密度。按照1.3 項下處理后進樣，計算血漿中ET-26鹽酸鹽和依托咪酯酸峰面積與內標的比值，代入標準曲線，求得實測濃度。計算日內和日間的精密度。測定結果如表1～表3所示。

表1 Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽日內精密度測定結果（ n = 6）

表2 Beagle犬血漿中依托咪酯酸日內精密度測定結果（ n = 6）

表3 Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽、依托咪酯酸日間精密度測定結果

2.9 穩定性考察

2.9.1 儲備液長期冷藏放置的穩定性

將ET-26鹽酸鹽儲備液（1.045 mg/mL）、依托咪酯酸儲備液（1.054 mg/mL）于4 ℃條件下放置7，14，30 d 后，按照1.2項下，稀釋后進樣分析，以考察儲備液長期冷藏的穩定性。結果表明，ET-26鹽酸鹽儲備液于4 ℃條件下放置30 d后的平均偏倚率為-0.33%，依托咪酯酸鹽儲備液于4 ℃條件下放置30 d后的平均偏倚率為0.28%，故儲備液可在4 ℃條件下放置30 d。

2.9.2 樣品處理前冰凍（-80 ℃）的穩定性

考察樣品處理前在-80 ℃下放置的穩定性，即取配置好的含低、中、高3種濃度的空白血漿加標樣品，在-80 ℃下放置，分別于第15 d、30 d取樣測定。測定結果顯示，ET-26鹽酸鹽和依托咪酯酸的低、中、高濃度變化的RSD值均在3.8% ～ 7.8%之間，說明該樣品處理前可在-80 ℃條件下放置30 d。

2.9.3 樣品處理前凍融穩定性

取配制好的低、中、高3種濃度空白血漿加標樣品，分別在室溫與-80 ℃條件下反復凍融3次后取樣分析。ET-26鹽酸鹽和依托咪酯酸的低、中、高濃度變化的RSD分別在5.3% ～ 7.3%和2.7% ～7.4%之間，說明該樣品處理前凍融穩定性良好。

2.10 藥動學參數

取9只成年Beagle犬禁食12 h，分為高、中、低3組，分別靜脈注射給藥7.68，3.84，1.92 mg/kg，給藥后均在0.5，1，2，3，4，5，10，20，30，60，120，180，240，300 min后采集靜脈血0.8 mL于編號后的離心管中，迅速加入40 μL氟化鈉（40 mg/mL），上下翻轉混合，3 500 r/min離心15 min制備血漿，取出上層血漿，分兩份轉入1.5 mL的EP管中，于-80 ℃保存。待測血漿按照1.3 項下處理后進樣，并計算每個血漿樣本的血藥濃度，其高、中、低濃度藥時曲線如圖4～圖6所示。實驗中所測得的所有血藥濃度數據，用DAS3.2.1軟件進行優度選擇和房室模型擬合。給藥劑量為1.92，3.84，7.68 mg/kg時的主要藥代動力學參數分別為：t1/2=78.96，36.51，32.947 min； AUC（0-t）= 46.09，570，565.3 μg·L-1·min；AUC（0-∞）= 47.70，577，567.9 μg·L-1·min；表觀分布容積V= 4 369，351.1，591.85 L/kg；CL = 40.95，6.67，12.449 L/（min·kg）。

圖4 Beagle犬高劑量組血漿藥物（ET-26鹽酸鹽）濃度-時間圖（Dose: 7.68 mg/kg）

圖5 Beagle犬中劑量組血漿藥物（ET-26鹽酸鹽）濃度-時間圖（Dose: 3.84 mg/kg）

3 結束語

本實驗成功建立了用LC-MS/MS準確測定Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽及其代謝產物依托咪酯酸的實驗方法。該方法在+ESI離子化方式下，以依托咪酯雜質C的定量離子對為m/z259.0/155.1為內標，通過檢測ET-26鹽酸鹽的碎片離子m/z275.3/105.1進行MRM定量。該方法穩定性良好，提取回收率高，內源性雜質無干擾，基質不影響檢測結果，能有效應用于Beagle犬血漿中ET-26鹽酸鹽及其代謝產物依托咪酯酸的定量檢測。

圖6 Beagle犬低劑量組血漿藥物（ET-26鹽酸鹽）濃度-時間圖（Dose: 1.92 mg/kg）

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