光學純(R)-3-奎寧醇制備技術研究進展

,,,,,

(浙江工業大學 藥學院,浙江 杭州 310014)

(R)-3-奎寧醇,化學名(3R)-1-氮雜雙環[2.2.2]辛-3-醇,是合成新型抗膽堿能藥的關鍵手性中間體,如治療帕金森病的他沙立定(talsaclidine)[1]、治療慢性阻塞性肺疾病的阿地溴銨(aclidinium bromide)[2-3]和瑞伐托酯(revatropate)[4]以及治療尿失禁的索利那辛(solifenacin)[5-6]等.該類藥物的應用十分廣泛,既可應用于日常的疾病治療,也可用于軍事上對抗化學武器.因此,(R)-3-奎寧醇的合成研究備受關注,其制備方法主要有化學拆分法、化學不對稱合成、動力學拆分以及生物不對稱還原法等,其中生物不對稱還原法由于其立體選擇性高、反應條件溫和、環境友好等優勢而備受關注[7-8].

1 化學合成法

1.1 化學拆分法

化學拆分法是獲得手性化合物的經典方法之一.李書彬等[9]在甲醇溶液中利用硼氫化鉀還原法將3-奎寧酮鹽酸鹽還原為外消旋3-奎寧醇,再以V(丙醇)∶V(丙酮)=3∶1的混合溶劑為反應介質,以D-(+)-二苯甲酰酒石酸為拆分劑對外消旋體進行拆分,所得固體經重結晶后得到(R)-3-奎寧醇,e.e.值98%,產率為20.4%.類似的,Ji等[10]利用(L)-酒石酸在乙醇溶液中拆分17.9 g的(+/-)-1-氮雜雙環[2.2.2]辛基-3-苯甲酸酯,拆分產物經15%氫氧化鈉水解得到1.35 g(R)-3-奎寧醇.利用化學拆分法制備單一構型(R)-3-奎寧醇產物需使用手性化學拆分劑,步驟較多,產率偏低.

1.2 化學不對稱催化

Tsutsumi等[11]合成了可用于催化3-奎寧酮不對稱加氫制備(R)-3-奎寧醇的化學催化劑XylSkewphos/PICA-Ruthenium,反應過程中底物和催化劑摩爾比為100 000,4.3 kg底物反應4 h后,(R)-3-奎寧醇的e.e.值為88%.為提高產物e.e.值,該課題組[12]在異丙醇中采用RuCl2[(S)-binap][(R)-iphan]和t-C4H9OK復合催化劑體系,將3-奎寧酮不對稱還原為(R)-3-奎寧醇,e.e.值大于97%,合成路線為

徐亮等[13]以(S,S)xylskewphosRuBr2QUIMA為手性催化劑,在堿性條件下經不對稱還原氫化制得(R)-3-奎寧醇,產物e.e.值大于95%,轉化率大于99.5%.化學不對稱催化制備(R)-3-奎寧醇的反應過程中使用少量的金屬手性催化劑即可獲得較高收率,但金屬手性催化劑價格較高,制備過程復雜,增加了反應成本,且部分催化劑不易回收重復利用,對環境造成一定的污染.

2 生物合成法

2.1 酶法拆分

Nomoto等[14]利用酶法拆分制備(R)-3-奎寧醇.首先將丁酸酐與外消旋奎寧醇進行反應制得奎寧酯,利用質量濃度為10 g/L的蜂蜜曲霉蛋白酶水解2 mol質量濃度為571 g/L的奎寧酯,反應24 h后,萃取得到R型奎寧丁酸酯,然后使用甲醇和碳酸鈉將該酯分解,獲得e.e.值為96%的(R)-3-奎寧醇,收率為42%,合成路線為

Muchmore等[15]將低脂肪酸酐與外消旋奎寧酯反應制得一系列奎寧酯,然后利用枯草桿菌蛋白酶催化酯水解,由于該蛋白酶對S構型酯的選擇性更強,故優先水解S構型酯獲得(S)-3-奎寧醇,分離R構型酯并進一步水解后得到所需的(R)-3-奎寧醇產物.Primozic等[16]合成了一系列具有保護基團的奎寧酯,以馬血清丁酰膽堿酯酶為生物催化劑,37 ℃下進行酯水解反應,當酯被水解至50%左右時終止反應,加入適量甲酸銨和10% Pd-C進行相轉移催化加氫反應制得光學純(R)-3-奎寧醇,產率低于50%.

利用酶法拆分制備(R)-3-奎寧醇多以外消旋奎寧醇為原料,與適當的酸酐反應制得相應的奎寧酯,再以具有對映選擇性的水解酶為生物催化劑,對奎寧酯進行酶選擇性拆分制得(R)-3-奎寧醇.此方法可獲得高光學純度的(R)-3-奎寧醇,但拆分產率不超過50%,并且需要先合成得到奎寧酯,反應結束后還需除去剩余酯,步驟多且繁瑣,因此不適合大規模生產.

2.2 生物不對稱還原法

生物不對稱還原法包括酶催化和全細胞催化,具有反應條件溫和、立體選擇性高、環境友好等優點,可用于制備多種手性化合物[17].酶催化的反應專一性高、副產物少,但酶的分離純化過程復雜,反應過程中酶的穩定性不高、易失活,且需要添加昂貴的輔酶.全細胞催化是利用微生物細胞催化潛手性酮不對稱還原得到所需構型的手性醇.由于微生物細胞內具有完善的代謝體系和酶系,不需額外添加輔因子,也可省去胞內酶的分離純化過程,因而逐漸受到關注[18-20].

邱健等[21]以3-奎寧酮鹽酸鹽為唯一碳源,從100多份土樣中篩選得到可高選擇性不對稱還原3-奎寧酮鹽酸鹽制備(R)-3-奎寧醇的微生物菌株,命名為RhodotorulamucilaginosaX 15,經工藝優化后,質量濃度為300 g/L的濕菌體催化5 mmol底物轉化為(R)-3-奎寧醇的產率為90%,e.e.值為88%,當底物濃度大于5 mmol/L時,出現明顯的底物抑制現象.Kolet等[22]利用梨形毛霉催化相同底物的不對稱還原,底物質量濃度為2.0 g/L,轉化12 d后(R)-3-奎寧醇產率為73%,e.e.值為96%.反應結束后以強陽離子交換樹脂-Amberlite IR-120對產物進行分離純化,避免了萃取過程中二氯甲烷等有機試劑的使用,是一種綠色環保的分離方法.Wang等[23]從土壤中篩選得到Nocardiasp. WY1202和RhodococcuserythropolisWY1406菌株,可將底物3-奎寧酮鹽酸鹽分別轉化為(R)-3-奎寧醇和(S)-3-奎寧醇,e.e.值大于99%,合成途徑為

優化后Nocardiasp. WY1202在pH 7.0的磷酸緩沖液中將99 mmol/L的3-奎寧酮鹽酸鹽底物還原為(R)-3-奎寧醇,轉化率達95.3%.利用篩選的野生菌催化3-奎寧酮鹽酸鹽不對稱還原制備(R)-3-奎寧醇只需一步反應即可獲得產物,反應條件溫和且產物易分離獲取,但催化轉化的底物量偏低.

Uzura等[24]從RhodotorularubraJCM3782中分離出一種NADPH依賴型羰基還原酶RrQR,可將3-奎寧酮不對稱還原為(R)-3-奎寧醇,并在大腸桿菌中共表達RrQR和葡萄糖脫氫酶,反應21 h后,該重組工程菌可將618 mmol(100 g/L)3-奎寧酮鹽酸鹽還原為(R)-3-奎寧醇,產率達98.6%,e.e.值>99.9%.Isotani等[25-26]從MicrobacteriumluteolumJCM 9174中分離出2 種可將3-奎寧酮不對稱還原為(R)-3-奎寧醇的羰基還原酶QNR和bacC,以大腸桿菌為表達載體共表達羰基還原酶和來源于雷弗松氏菌的醇脫氫酶.轉化體系中加入異丙醇作為輔助底物用于輔酶再生,并采用連續補料方式以解除高濃度底物和異丙醇對生物催化劑活性的抑制作用.為進一步提高生物催化劑的重復使用批次,采用聚乙烯亞胺和戊二醛對重組大腸桿菌細胞進行固定化.研究發現:采用E.coil/pET28-QNR和E.coil/pKELA質量比為1∶1的固定化細胞作為生物催化劑,在含10%異丙醇、pH 7.0的磷酸鉀緩沖溶液中加入適量固定化細胞,反應48 h可將939 mmol/L(150 g/L)的3-奎寧酮完全轉化為(R)-3-奎寧醇產物,制備路線為

劉篤強[27]采用IMAC(Immobilized metal ion affinity chromatography)法實現了3-奎寧酮還原酶QNR和葡萄糖脫氫酶GDH的原位純化和固定化,以該固定化酶為催化劑制備(R)-3-奎寧醇的同時實現了輔酶的再生循環.當反應體系中底物與固定化酶質量之比小于14∶1時,底物可完全轉化為產物,該固定化酶可重復使用8次.與純酶催化相比,采用固定化酶不僅增加了酶穩定性,解決了酶回收和重復利用等問題,還實現了輔酶的再生和循環.此外,他還分別采用重組細胞和透性化處理細胞催化轉化3-奎寧酮制備(R)-3-奎寧醇.重組細胞可完全轉化的最大底物量與濕細胞的質量之比為13∶1,在反應體系中加入體積分數為0.4%的甲苯作為透性劑,可將反應時間縮短0.5～1 h,且e.e.值高達100%.應用透性化技術可增加細胞壁和細胞膜的通透性,提高胞內酶的催化效率.張文霞等[28-29]以不對稱還原3-奎寧酮制備(R)-3-奎寧醇為模型反應進行基因挖掘,利用來自放射性土壤桿菌ECU2556的奎寧酮還原酶ArQR催化底物3-奎寧酮還原為(R)-3-奎寧醇.通過鎳柱親和層析對該羰基還原酶進行分離純化,研究發現在40 ℃,pH 7.0條件下該羰基還原酶的活性最高.此外,還在大腸桿菌中共表達羰基還原酶ArQR和葡萄糖脫氫酶BmGDH,并對葡萄糖脫氫酶和羰基還原酶的串聯位置、初始底物加量、生物量和反應時間等因素進行考察,發現0.1 g重組工程菌在30 ℃反應4.5 h后可將質量濃度為242 g/L的底物完全轉化為(R)-3-奎寧醇,e.e.值>99%,時空產率達916 g/(L·d),制備路線為

竺偉等[30]以來源于高加索乳桿菌中酮還原酶突變體的重組酮還原酶為催化劑,實現了千克級(R)-3-奎寧醇的制備.反應體系中分別加入適量的重組酮還原酶粉、重組葡萄糖脫氫酶粉、葡萄糖、輔酶以及底物,利用TLC法監控反應進程,當轉化率高于99%時結束反應,最高可將7.5 kg的3-奎寧酮鹽酸鹽轉化為5.84 kg(R)-3-奎寧醇,摩爾收率為94%,純度大于95%,e.e.值大于99%,此反應可轉化的底物質量濃度高達500 g/L,與其他合成方法相比大大提高了制備效率.可用于生物不對稱還原制備(R)-3-奎寧醇的菌種種類較多,除紅酵母屬(Rhodotorulasp.)、諾卡菌屬(Nocardiasp.)和毛霉屬(Mucorsp.)外,戈登氏菌屬(Gordoniasp.)、地霉屬(Geotrichumsp.)、家村氏菌屬(Tsukamurellasp.)和克魯維酵母屬(Kluyveromycessp.)等也可還原3-奎寧酮制備光學純(R)-3-奎寧醇[31-33].受野生菌受細胞自身結構以及胞內酶數量有限等因素限制,致使底物產物在細胞內外的擴散受阻、可轉化的底物濃度有限、催化效率偏低.為此,研究人員采用基因挖掘、定點突變等技術獲得了多種可用于制備(R)-3-奎寧醇的羰基還原酶[34]、重組細胞[35-38]以及固定化酶或細胞[39],提高了生物催化劑的催化效率,為(R)-3-奎寧醇的工業化生產提供了技術支持.

3 結 論

(R)-3-奎寧醇作為抗膽堿能藥的關鍵手性中間體一直備受關注,研究人員也從多方面對其制備方法進行了探索.目前采用生物不對稱還原法制備(R)-3-奎寧醇的產量可達千克級,且反應條件溫和、環境友好,與其他制備方法相比更具有工業化應用前景.雖然采用分離純化或基因挖掘等方法獲得的奎寧酮還原酶的催化能力較強,但在轉化體系中酶的穩定性較低,因此可考慮通過定向進化[40-41]等方法進一步提高酶的穩定性,同時利用固定化酶或固定化細胞以實現生物催化劑的重復利用,提高催化效率,降低制備過程的生產成本,更好地實現工業化生產應用.

參考文獻：

[1] ENSINGER H A, BECHTEL W, BIRKE F W, et al. WAL 2014 FU(talsaclidine): a preferentially neuron activating muscarinic agonist for the treatment of Alzheimer’s disease[J].Drug development research,2015,40(2):144-157.

[2] BEIER J, MROZ R, KIRSTEN A M, et al. Improvement in 24-hour bronchodilation and symptom control with aclidinium bromide versus tiotropium and placebo in symptomatic patients with COPD: post hoc analysis of a phase III b study[J].International journal of chronic obstructive pulmonary disease,2017,12:1731-1740.

[3] MAGNUSSEN H, ARZT M, ANDREAS S, et al. Aclidinium bromide improves symptoms and sleep quality in COPD: a pilot study[J].European respiratory journal,2017,49(6):1700485.

[4] MCGORUM B C, NICHOLAS D R, FOSTER A P, et al. Bronchodilator activity of the selective muscarinic antagonist revatropate in horses with heaves[J].Veterinary journal,2013,195(1):80-85.

[5] YAMAGUCHI O, KAKIZALI H, HOMMA Y, et al. Solifenacin as add-on therapy for overactive bladder symptoms in men treated for lower urinary tract symptoms-assist, randomized controlled study[J].Urology,2011,78(1):126-133.

[6] KARRAM M, TOGLIA M S, ANDOH M, et al. Treatment with solifenacin increases warning time and improves symptoms of overactive bladder: results from VENUS, a randomized, double-blind, placebo-controlled trial[J].Urology,2009,73(1):14-18.

[7] 胡琦蔚,張俊偉,王遠山.生物催化法制備手性酮基布洛芬的研究進展[J].發酵科技通訊,2017,46(3):153-157.

[8] BORNSCHEUER U T, HUISMAN G W, KAZLAUSKAS R J, et al. Engineering the third wave of biocatalysis[J].Nature,2012,485:185-194.

[9] 李書彬,申永存,曾鵬.3-奎寧醇的拆分研究[J].安徽化工,2009,35(1):31-33.

[10] JI J G, LI T, WANG Y. 3-Quinuclidinyl amino-substituted biaryl derivatives: US7309699[P].2007-12-18.

[11] TSUTSUMI K, KATAYAMA T, UTSUMI N, et al. Practical asymmetric hydrogenation of 3-quinuclidinone catalyzed by the XylSkewphos/PICA-Ruthenium(II) complex[J].Organic process research & development,2009,13(3):625-628.

[12] ARAI N, AKASHI M, SUGIZAKI S, et al. Asymmetric hydrogenation of bicyclic ketones catalyzed by BINAP/IPHAN-Ru(II) complex[J].Organic letters,2010,12(15):3380-3383.

[13] 徐亮.一種制備(R)-3-奎寧環醇的方法:CN105085513A[P].2015-11-25.

[14] NOMOTO F, HIRAYAMA Y, IKUNAKA M, et al. A practical chemoenzymatic process to access(R)-quinuclidin-3-ol on scale[J].Tetrahedron asymmetry,2003,14(13):1871-1877.

[15] MUCHMORE D C. Enantiomeric enrichment of(R,S)-3-quinuclidinol: US, EP 0577253 A2[P].1993-06-01.

[16] PRIMOZIC I, BOLANT M, RAMIC A, et al. Preparation of novelmeta- andpara-substituted N-benzyl protected quinuclidine esters and their resolution with butyrylcholinesterase[J].Molecules,2012,17(1):786-795.

[17] 白東亞,何軍邀,歐陽斌,等.手性芳基醇的生物催化不對稱合成[J].化學進展,2017,29(5):491-501.

[18] TORRELO G, HANEFELD U, HOLLMANN F. Biocatalysis[J].Catalysis letter,2015,145(1):309-345.

[19] BOMMARIUS A S. Biocatalysis: a status report[J].Annual review of chemical & biomolecular engineering,2015,6(1):319-345.

[20] 何軍邀,白東亞,王普.惡臭假單胞菌產羰基還原酶的發酵條件優化[J].發酵科技通訊,2017,46(4):243-248.

[21] 邱健,張霞,馬宏,等.轉化奎寧酮為(R)-3-奎寧醇菌株的篩選及轉化條件優化[J].微生物學通報,2011,38(5):736-742.

[22] KOLET S P, JADHAV D D, PRIYADARSHINI B, et al. Fungi mediated production and practical purification of(R)-(-)-3-quinuclidinol[J].Tetrahedron letters,2014,55(43):5911-5914.

[23] WANG Y, LI J, WU Q, et al. Microbial stereospecific reduction of 3-quinuclidinone with newly isolatedNocardiasp. andRhodococcuserythropolis[J].Journal of molecular catalysis B enzymatic,2013,88:14-19.

[24] UZURA A, NOMOTO F, SAKODA A, et al. Stereoselective synthesis of(R)-3-quinuclidinol through asymmetric reduction of 3-quinuclidinone with 3-quinuclidinone reductase ofRhodotorularubra[J].Applied microbiology & biotechnology,2009,83(4):617-626.

[25] ISOTANI K, KUROKAWA J, ITOH N. Production of(R)-3-quinuclidinol byE.colibiocatalysts possessing NADH-dependent 3-Quinuclidinone reductase(QNR or bacC) fromMicrobacteriumluteolumandLeifsoniaalcohol dehydrogenase(LSADH)[J].International journal of molecular sciences,2012,13(10):13542-13553.

[26] ISOTANI K, KUROKAWA J, SUZUKI F, et al. Gene cloning and characterization of two NADH-dependent 3-Quinuclidinone reductases fromMicrobacteriumluteolumJCM 9174[J].Applied environment microbiology,2013,79(4):1378-1384.

[27] 劉篤強.生物催化不對稱合成(R)-3-奎寧醇[D].重慶:重慶醫科大學,2016.

[28] ZHANG W X, XU G C, HUANG L, et al. Highly efficient synthesis of(R)-3-Quinuclidinol in a space-time yield of 916 g·L-1·d-1using a new bacterial reductase ArQR[J].Organic letters,2013,15(19):4917-4919.

[29] 張文霞.奎寧酮還原酶的挖掘及在制備(R)-3-奎寧醇中的應用性能[D].上海:華東理工大學,2014.

[30] 竺偉,高新星,吳會等.重組酮還原酶在制備(R)-3-奎寧酮中的應用:CN 107435042 A[P].2017-12-05.

[31] SHINYA I. Method for producing optically active 3-quinuclidinol: JP2002153293[P].2002-05-28.

[32] MAKOTO G, MAKOTO U. Production ofR-3-quinuclidinol: JP2000245495[P].2000-09-12.

[33] KAWANO S, NISHIHACHIJYO M, YASOHARA Y, et al. Process for production of(R)-3-quinuclidinol: EP2423320A1[P].2012-02-29.

[34] HOU F, MIYAKAWA T, TAKESHITA D, et al. Expression, purification, crystallization and X-ray analysis of 3-quinuclidinone reductase fromAgrobacteriumtumefaciens[J].Acta crystallographica,2012,68(10):1237-1239.

[35] SPICKERMANN D, HAUSMANN S, EBER S, et al. Variants of the parvibaculum lavamentivorans short-chain alcohol dehydrogenase: EP2904097[P].2015-06-14.

[36] JIA Z, MA H, HUANG Y, et al. Production of(R)-3-quinuclidinol by a whole-cell biocatalyst with high efficiency[J].Biocatalysis & biotransformation,2017:1-8.

[37] 馬宏,胡美榮,賈振華,等.一種奎寧酮還原酶KgQR的制備方法及其在制備(R)-3-奎寧醇中應用:CN 106282134 A[P].2017-01-04.

[38] 羅煜,丁時澄,翟旭東,等.一種羰基還原酶及其在制備(R)-3-奎寧醇中的應用:CN 104830814A[P].2015-08-12.

[39] 孫立力,劉篤強,李偉,等.磁性聯合交聯酶聚集體生物催化劑及其制備方法和應用:CN 107227301A[P].2017-10-03.

[40] 何人寶,胡忠梁,金逸中,等.瑞舒伐他汀側鏈(3R,5S)-6-R-取代基-3,5-二羥基己酸叔丁酯合成研究進展[J].發酵科技通訊,2017,46(3):188-192.

[41] SPICKERMANN D, HAUSMANN S, DEGERING C, et al. Engineering of highly selective variants ofParvibaculumlavamentivoransalcohol dehydrogenase[J].Chembiochem,2015,15(14):2050-2052.