基于LC-MS/MS的咖啡?？鼘幩岙悩嬻w鑒別方法研究

李麗麗，馬雙雙，趙恒強，劉 偉，王 曉

(齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

咖啡?？鼘幩犷惢衔锸侵参镏谐Ｒ姷囊活愄烊环铀犷惢衔?，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性，是天然藥物發揮藥效活性的重要物質基礎之一[1-2]?？Х弱？鼘幩崾怯煽鼘幩岷筒煌瑪的康目Х弱；ㄟ^酯化反應縮合而成[3]。自然界中的咖啡?？鼘幩岚▎慰Х弱？鼘幩?、二咖啡?？鼘幩?、三咖啡?？鼘幩岷投嗫Х弱？鼘幩?，其中單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩嵩谥参镏袕V泛存在[4]。

圖1 單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬姆肿咏Y構圖Fig.1 Molecule structures of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids R represents caffeoyl group(R代表咖啡?；?

咖啡?？鼘幩岬姆治龇椒òǜ咝б合嗌V法[5-6]、毛細管電泳法[7]、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[8-9]等。液相色譜-質譜聯用法集成了液相色譜的高效分離能力和質譜的高靈敏度特點，在咖啡?？鼘幩岬姆蛛x分析中得到更為廣泛的應用。由于咖啡?；涂鼘幩岬孽セ稽c不同，咖啡?？鼘幩犷惢衔锎嬖谠S多位置異構體[10-11]。如金銀花中分離出單咖啡?？鼘幩犷惢衔铩?-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩?，以及二咖啡?？鼘幩犷惢衔铩?,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩醄12]。這些化合物在分子結構上咖啡?；鶖的坎煌蝓セ恢貌煌?圖1)，而結構上的差異則會引起藥效活性的顯著不同。研究發現二咖啡?？鼘幩犷惢衔锴宄鼶PPH自由基和超氧陰離子的能力高于單咖啡?？鼘幩犷惢衔?，具有更強的抗氧化活性[13]。4,5-二咖啡?？鼘幩嵬ㄟ^激活瞬時受體電位香草酸受體1(TRPV1)抑制炎癥反應，而其它咖啡?？鼘幩峄衔镂窗l現這種作用機制[14]。因此，咖啡?？鼘幩嵛恢卯悩嬻w的準確識別對植物功效物質的開發具有重要意義。前期實驗發現，咖啡?？鼘幩岬奈恢卯悩嬻w在MS/MS分析下具有相同的碎片離子，給其定性帶來了困難。不同碰撞能誘導的二級質譜裂解特征可對不同位置異構體進行區分[15-16]。本研究對單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩嵛恢卯悩嬻w的色譜保留和不同碰撞能下的二級質譜裂解規律進行了系統研究，以實現LC-MS/MS分析下的快速鑒別。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

乙腈、甲醇(色譜級,德國默克公司)，甲酸(色譜級,德國Honeywell Fluka)，3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩?、5-O-咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩峒?,5-O-二咖啡?？鼘幩針藴势焚徸陨虾Ｔ慈~生物科技有限公司;超高效液相色譜儀(ACQUITY,H-Class,美國沃特世)，飛行時間質譜(Q-TOF-MS，Impact Ⅱ,德國布魯克);超純水由Millipore Direct-Q 8 UV-R超純水系統(美國)制備。

1.2 標準品溶液的配制

將標準品3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩?、5-O-咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩嵊眉状?水(1∶1，體積比) 溶液溶解，配制成1 mg/mL的母液。

1.3 液相色譜條件

將3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩?、5-O-咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩嵩诓煌疵撎荻认逻M行分析。色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm，美國)，流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃。流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動相B為純乙腈溶液，設置不同的洗脫梯度(見表1)。

表1 不同洗脫梯度下的流動相組成Table 1 Composition of mobile phases with different elution gradients

1.4 MS/MS條件

在正離子模式下進行采集。質量數范圍為50～1 000，毛細管電壓3 500 V，霧化氣壓力30 kPa,干燥氣流速4 L/min，干燥氣溫度200 ℃，碰撞池碰撞能10 eV，傳輸時間80 μs，碰撞池射頻電壓振幅750 Vpp,脈沖前等待時間8 μs,二級碰撞能設置為15～80 eV。

1.5 金銀花中咖啡?？鼘幩岬姆治?/h3>

稱取金銀花100 mg，加入1 mL的甲醇-水(1∶1，體積比)溶液，渦旋5 min。離心10 min，取上清液進行LC-MS/MS分析。色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm),流速為0.4 mL/min,柱溫為40℃。流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動相B為純乙腈溶液。洗脫梯度設置為：0～5 min，7% B；5～10 min，7%～10% B；10～13 min，10%～25% B；13～16 min，25%～33% B；16～17 min，33%～50% B；17～19 min，50% B；19～19.1 min，50%～5% B；19.1～23 min，5% B。質譜條件設置如下：毛細管電壓3 500 V,霧化氣壓力200 kPa,干燥氣流速8 L/min,干燥氣溫度200 ℃,碰撞池碰撞能7 eV，傳輸時間60 μs，碰撞池射頻電壓振幅750 Vpp,脈沖前等待時間5 μs，二級碰撞能設置為15～45 eV。

1.6 數據處理

超高效液相色譜和高分辨質譜采集的數據由Data Analysis 軟件(德國布魯克)進行數據處理。對不同碰撞能下的二級質譜數據，導出譜圖中的母離子、子離子以及強度信息。并提取出不同洗脫梯度下單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬谋Ａ魰r間數據。

2 結果與討論

2.1 單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬纳V保留分析

使用Agilent Poroshell 120 SB-Aq C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，在不同的洗脫梯度下，單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬谋Ａ魰r間見表2。單咖啡?？鼘幩嵩贑18柱上的保留較弱，洗脫時間在前。而二咖啡?？鼘幩嵩贑18柱上的保留較強，洗脫時間在后?？Х弱；脑黾訙p小了咖啡?？鼘幩岬臉O性，使得其在C18色譜柱的保留增強。洗脫梯度改變，咖啡?？鼘幩岜Ａ魰r間的絕對值發生變化，但其洗脫順序未發生改變。單咖啡?？鼘幩嵩贑18色譜柱的6個不同梯度下的洗脫順序均為5-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩?、3-O-咖啡?？鼘幩?，而二咖啡?？鼘幩岬南疵擁樞蚓鶠?,4-O-二咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩?。該色譜保留特征可為咖啡?？鼘幩嵛恢卯悩嬻w的鑒別提供參考。

表2 單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩嵩诓煌疵撎荻认碌谋Ａ魰r間Table 2 Retention times of monocaffeoylquinic acids and dicaffeoylquinic acids with different elution gradients t/min

2.2 單咖啡?？鼘幩岬亩壻|譜分析

3-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩崾怯梢粋€咖啡酸和奎寧酸酯化而成。在低碰撞能下，其二級質譜圖(以3-O-咖啡?？鼘幩釣槔?中主要信號離子包括母離子377和子離子215、163(圖2A、B)；在高碰撞能下，其主要信號離子包括子離子163、145、135、117(圖2C)。其中，信號離子163、145、135和117是咖啡?；奶卣髯与x子。隨著碰撞能的增加，母離子377的信號強度逐漸減弱，子離子163的信號強度逐漸增加，成為基峰。在碰撞能25～35 eV時，母離子377和子離子163的強度變化最為顯著?？疾炝?種碰撞能(25、30、35 eV)下377/163強度比值的變化情況，發現隨著碰撞能的增加，377/163的強度比值逐漸減小，此比值在單咖啡?？鼘幩嶂械拇笮№樞蛞来螢?-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩?圖2D)。單咖啡?？鼘幩岬慕Y構區別是奎寧酸和咖啡酸的酯化位置不同，子離子163由酯鍵發生斷裂產生。分析結果說明單咖啡?？鼘幩嶂?-O-咖啡?？鼘幩嶙铍y發生裂解，5-O-咖啡?？鼘幩嶙钜装l生裂解，這與其幾何結構、空間位阻和結構穩定性有關。

圖2 不同碰撞能下,3-O-咖啡?？鼘幩岬亩壻|譜圖(A～C)和單咖啡?？鼘幩嶂?77/163的強度比值分布圖(D)Fig.2 MS/MS spectra of 3-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 377/163(D) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.3 二咖啡?？鼘幩岬亩壻|譜分析

3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩崾怯?個咖啡酸和奎寧酸酯化而成。相對于單咖啡?？鼘幩?，在二級質譜分析時，二咖啡?？鼘幩崾紫葋G失1個咖啡?；?，出現質量數為377的信號峰。二咖啡?？鼘幩嵩诘团鲎材芟?3,5-O-二咖啡?？鼘幩釣槔?，主要信號離子包括母離子539和子離子377(圖3A、B)，在高碰撞能下，其主要信號離子包括子離子377、215、163、145、135，子離子163成為基峰(圖3C)。隨著碰撞能的增加，母離子539的信號強度逐漸減弱。子離子377的信號強度在25～35 eV范圍內隨著碰撞能的增加而顯著增強，在35～45 eV范圍內則隨著碰撞能的增加顯著減弱。子離子163在35～45 eV顯著增強。在25、30、35 eV碰撞能下，母離子539和子離子377的強度比值(539/377)順序為4,5-O-二咖啡?？鼘幩?3,4-O-二咖啡?？鼘幩?3,5-O-二咖啡?？鼘幩?圖3D)。在35、40、45 eV碰撞能時，子離子377和163的強度比值(377/163)順序為3,5-O-二咖啡?？鼘幩?4,5-O-二咖啡?？鼘幩?3,4-O-二咖啡?？鼘幩?圖3E)。通過二咖啡?？鼘幩崮鸽x子539和子離子377的強度變化趨勢，結合單咖啡?？鼘幩岬牧呀庖幝?，推測3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岱謩e首先發生5-位、4-位和5-位的酯鍵斷裂得到子離子377。結果說明由于二咖啡?？鼘幩嶂锌Х弱；〈恢貌煌斐闪似淇臻g位阻、結構穩定性的差異，其中，4,5-O-二咖啡?？鼘幩嶙铍y發生裂解，3,5-O-二咖啡?？鼘幩嶙钜装l生裂解。

圖3 不同碰撞能下，3,5-O-二咖啡?？鼘幩岬亩壻|譜圖(A～C),以及二咖啡?？鼘幩嶂?39/377(D)、377/163(E)的強度比值分布圖Fig.3 MS/MS spectra of 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (A-C) and intensity ratios of 539/163(D) and 377/163(E) at different collision energiesA:25 eV;B:35 eV;C:45 eV

2.4 實際應用

圖4 金銀花中咖啡?？鼘幩岬奶崛‰x子流色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of caffeoylquinic acids in honeysuckle1.5-O-caffeoylquinic acid,2.4-O-caffeoylquinic acid,3.3-O-caffeoylquinic acid,4.3,4-di-O-caffeoylquinic acid,5.3,5-di-O-caffeoylquinic acid,6.4,5-di-O-caffeoylquinic acid

單咖啡?？鼘幩岬亩壻|譜裂解特征碎片離子為215、163、145、135、117。二咖啡?？鼘幩岬亩壻|譜裂解特征碎片離子為377、215、163、145、135。在金銀花的LC-MS/MS分析中，通過精確質量數和二級質譜特征，基于4.4 min(峰1)，9.1 min(峰2)和9.4 min(峰3)識別出單咖啡?？鼘幩犷惓煞?，基于15.4 min(峰4)、15.7 min(峰5)和16.0 min(峰6)識別出二咖啡?？鼘幩犷惓煞?圖4)。對于單咖啡?？鼘幩岢煞?，377/163的強度比值在25 eV時依次為峰3(16.1)>峰2(3.4)>峰1(2.5)。對于二咖啡?？鼘幩岢煞?，539/377的強度比值在25 eV時依次為峰6(4.4)>峰4(3.2)>峰5(1.9)，377/163的強度比值在35 eV時依次為峰5(3.0)>峰6(1.7)>峰4(1.5)。同時參考洗脫順序，金銀花中峰1、峰2和峰3分別鑒別為5-O-咖啡?？鼘幩?、4-O-咖啡?？鼘幩岷?-O-咖啡?？鼘幩?，峰4、峰5和峰6分別鑒別為3,4-O-二咖啡?？鼘幩?、3,5-O-二咖啡?？鼘幩岷?,5-O-二咖啡?？鼘幩?，并通過標樣驗證。

3 結 論

單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩崾侵参锝缰谐Ｒ姷亩喾宇惢衔?，由于咖啡?；c奎寧酸的酯化位置不同，而存在很多位置異構體。本研究對單咖啡?？鼘幩岷投Х弱？鼘幩岬奈恢卯悩嬻w進行了色譜和二級質譜分析?？Х弱；脑黾訙p小了咖啡?？鼘幩岬臉O性，使其在C18色譜柱的保留增強。單咖啡?？鼘幩岬奶卣魉槠x子有215、163、145、135、117，可通過母離子377和子離子163的強度比值(377/163)進行區分。二咖啡?？鼘幩岬奶卣魉槠x子有377、215、163、145、135，可通過母離子539、子離子377和163的強度比值(539/377、377/163)進行區分?？Х弱？鼘幩犷惢衔锏纳V保留和質譜裂解規律的揭示為其位置異構體的快速鑒別提供了方法指導。