HPLC法測定4硝基苯丙胺鹽酸鹽中有關物質2硝基苯丙胺鹽酸鹽的含量

馬向霞，馬志平，侯美羽，蘇艷華

(天津市醫藥集團技術發展有限公司，天津 300193)

馬向霞，馬志平，侯美羽，蘇艷華

(天津市醫藥集團技術發展有限公司，天津 300193)

目的：建立用HPLC法測定4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中有關物質2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的方法。方法：采用C18色譜柱，以0.020 mol/L磷酸二氫銨(2%三乙胺，磷酸調pH 4.5)-乙腈(95∶5)為流動相，流速為1.0 ml/min，檢測波長為220 nm，柱溫為30 ℃。結果：2-硝基苯丙胺鹽酸鹽與相鄰雜質峰及主成分分離良好，2-硝基苯丙胺鹽酸鹽在0.496～11.904 μg/ml濃度范圍內與峰面積線性關系良好(r=0.999 8)，定量限為5.0 ng，檢測限為2.5 ng，平均回收率(n=9)為98.3%，RSD為3.5%；結論：該方法適用于4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的測定，方法簡便，結果準確。

4-硝基苯丙胺，2-硝基苯丙胺，有關物質，高效液相色譜法

隨著藥品研發要求不斷提高，起始原料中有關物質控制是質量控制的重中之重。4-硝基苯丙胺鹽酸鹽在合成過程中可能引入的主要有關物質為2-硝基苯丙胺鹽酸鹽，其為4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的同分異構體，會直接參與后續反應，含量過高，后續步驟又不能有效去除，則可能導致成品原料藥質量不合格，所以控制4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的含量就極為重要。

樣品中異構體含量可采用氣相色譜法進行檢測[1,2]。選擇合適的流動相條件，樣品中同分異構體含量也可采用高效液相色譜法進行檢測[3]。本法建立了4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中有關物質2-硝基苯丙胺鹽酸鹽檢測的高效液相色譜法，操作簡便，靈敏度高，重復性好，專屬性強。參照《中國藥典》[4]進行了方法學驗證。該方法適用于4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中的有關物質2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量測定。用本方法對3個批次4-硝基苯丙胺鹽酸鹽中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽進行檢測，結果表明3批4-硝基苯丙胺鹽酸鹽樣品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量均小于1.0%。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-20A紫外檢測器，島津LC-Solution色譜工作站，日本島津公司)；天平(賽多利斯BT25S和賽多利斯BS110S)。4-硝基苯丙胺鹽酸鹽(蘇州愛瑪特生物科技有限公司，批號131007，純度99.70%)；2-硝基苯丙胺鹽酸鹽(天津市醫藥集團技術發展有限公司，批號140505，純度97.9%)；三乙胺為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；乙腈為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.020 mol/L磷酸二氫銨(2%三乙胺，磷酸調pH 4.5)-乙腈(95∶5)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。在上述色譜條件下，4-硝基苯丙胺鹽酸鹽和2-硝基苯丙胺鹽酸鹽理論塔板數分別為8 838和7 613，均大于5 000，符合要求。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取適量2-硝基苯丙胺鹽酸鹽，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含20 μg的溶液，作為對照品貯備液，精密量取5 ml，置10 ml量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取適量4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液制備 精密稱取4-硝基苯丙胺鹽酸鹽對照品適量，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的溶液，搖勻，即得。

2.3 系統適用性考查 精密稱取適量4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，用流動相溶解并稀釋制成每1 ml含1 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的溶液，注入液相色譜儀，考查2-硝基苯丙胺與相鄰雜質間的分離度。結果2-硝基苯丙胺鹽酸鹽與相鄰雜質最小分離度為2.1，4-硝基苯丙胺鹽酸鹽和2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的分離度為12.4，分離度均符合要求。見圖1。

2.4 線性關系考查 精密量取適量“2.2.1”項下的對照品貯備液，用流動相作為溶劑進行不同比例稀釋，制成各級線性對照品溶液，分別精密量取10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(C)，峰面積為縱坐標(A)進行線性回歸?；貧w方程為：A=13 987C-60.5(r=0.999 8)。結果表明，2-硝基苯丙胺鹽酸鹽在0.496～11.904 μg/ml范圍內，線性關系良好。

1. 2-硝基苯丙胺鹽酸鹽 2. 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽

2.5 重復性試驗 按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6份，按照“2.1”項下的色譜條件分別進樣，外標法以峰面積計算樣品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的含量，可得出6份供試品溶液中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽平均含量為0.20%，RSD為3.80%，結果表明方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗 取供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分別于室溫下0、2、4、8、12和24 h進樣，記錄色譜圖，考查供試品溶液中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量，24 h內2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量在0.19%～0.21%之間，結果表明供試品溶液室溫下放置24 h內穩定。

2.7 定量限與檢測限的測定 將對照品溶液稀釋后進樣，以信噪比10∶1時的進樣量(ng)為定量限，信噪比3∶1時的進樣量(ng)為檢測限，測得2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的定量限為5.0 ng，檢測限為2.5 ng。

2.8 回收率試驗 精密稱取約10 mg 4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，置10ml量瓶中，稱取9份，分別用“2.2.1”項下對照品貯備液4、5和6 ml各3份，分別置于上述9個10 ml量瓶中，流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得回收率試驗溶液。以“2.5”項下重復性實驗的數據作為加樣前回收率試驗溶液。按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，扣除本底后計算2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的回收率為98.3%，RSD為3.5%，見表1。

表1 回收率試驗結果

2.9 樣品測定 取3批4-硝基苯丙胺鹽酸鹽，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.1”項下色譜條件進樣測定，外標法以峰面積計算樣品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽的含量，結果見表2。

表2 樣品測定結果

3 討論

3.1 流動相的選擇 經比較，流動相pH大于5.0時，4-硝基苯丙胺鹽酸鹽拖尾因子較大，乙腈比例較大時，不能將4-硝基苯丙胺鹽酸鹽與2-硝基苯丙胺鹽酸鹽分開。加入2%三乙胺能大大改善4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的對稱因子，且所選用的流動相能使2-硝基苯丙胺鹽酸鹽與4-硝基苯丙胺鹽酸鹽的分離度達到12.4，最終確定流動相為0.020 mol/L磷酸二氫銨(2%三乙胺，磷酸調pH 4.5)-乙腈(95∶5)。

3.2 批次間雜質含量的差異 企業不同批次4-硝基苯丙胺鹽酸鹽之間2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量差異較大，考慮到起始原料的質量直接影響藥品中原料藥的質量，故原料藥生產企業在將4-硝基苯丙胺鹽酸鹽作為起始原料時應考查不同2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量對后續中間體及成品的影響，從而獲得滿意的原料藥產品。本方法的建立為以4-硝基苯丙胺鹽酸鹽為起始原料的原料藥企業購買合格的起始原料提供了良好的檢測方法，同時為4-硝基苯丙胺鹽酸鹽生產企業控制產品中2-硝基苯丙胺鹽酸鹽含量提供了準確的檢測方法。

1 王世玉，劉菲，劉玉龍. 氣相色譜-質譜法檢測地下水中12種壬基酚同分異構體[J]. 分析化學，2013，41(11)：1699-1703

2 林麒，李國波，葛品. 氣相色譜-質譜聯用法檢測母乳脂肪中反式脂肪酸[J]. 色譜，2016，34(5)：520-527

3 韓明友，申衛華，時軍. 反相高效液相色譜法分離和測定硝基苯酚的三種異構體[J]. 分子科學學報，1997，13(4)：247-250

4 中國藥典[S]. 四部.2015：374-377

2016-07-12

R927.2

A

1006-5687(2016)05-0026-03