基于NIR-SERS基底的肺癌氧合血紅蛋白NIR-SERS光譜研究

高 飛，張 明，朱紹玲，熊 洋

（1遵義醫學院物理教研室，貴州遵義562503；2遵義醫學院附屬醫院檢驗科，貴州遵義562500；3楚雄師范學院光譜技術應用研究所，云南 楚雄 675000）

0 引言

近些年來，肺癌這種常見惡性腫瘤的死亡率以及發病率均迅速攀升，極大地威脅著各國人民的生命健康［1］。 數據［2］顯示，我國每年死于肺癌的人數高達60余萬，這種疾病的累計危險性已經迅速攀升至首位。一直以來，醫學界均尚未探索出比較高效且完善的肺癌診斷治療方案，因此很難及時發現并診斷肺癌。這種情況直接導致了許多肺癌患者被誤診或病情延誤，往往在就診時已經發展至晚期。就現階段而言，支氣管鏡檢查、放射性核素檢查、細胞學檢查、X射線檢查、剖胸探查術、ECT檢查、縱膈鏡檢查等為臨床常見的肺癌診斷檢查方法［3－4］，不過從客觀上來講，上述方法都不是完善的，均存在著一定的缺陷與不足，如費用高昂，操作復雜度較高，靈敏度較低，會對患者造成創傷等。與此同時，應用這些方法診斷肺癌還存在著檢測盲區、假陰性等問題［5］。在這一背景下，想要有效提升肺癌患者的生存率，當務之急在于探索出一套安全、簡便的早期肺癌檢測方法。

利用靈敏度高、簡單快捷、生物兼容性好等優點的近紅外表面增強拉曼散射（near infrared surface?en?hanced Raman scattering，NIR?SERS）光譜技術可以直觀地獲取分子含量以及轉動、振動信息［6］。目前，這種技術在臨床領域已經有了基本的應用。醫學診斷領域也逐步引入了此項技術。在本研究中，將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜，對肺癌患者以及健康人進行NIR?SERS光譜檢測分析，主要通過785 nm近紅外激光波長來檢測并分析研究氧合血紅蛋白，有利于提高肺癌SERS光譜技術診斷效率以及可行性。從一定程度上來講，NIR?SERS技術具備應用于肺癌臨床診斷領域的潛力與價值。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 血液樣品：2015年5月至7月在遵義醫學院附屬醫院采集血液，從健康人和肺癌患者胳膊抽靜脈血液樣本各25例，樣品規格均為3 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取氧合血紅蛋白 第一步，血液樣本編號。完成編號后分別提取每個樣本各2 mL，37℃室溫放置使其自然凝結，放置時間為1 h，血樣凝結后利用小型臺式離心機進行5000 r／min，5 min的離心處理，待樣品分層后將下層血紅細胞提取出并分裝至新的離心管中，提取量為200 μL。向提取的紅細胞中加入九倍體積的去離子水，緩慢混合后再次進行5000 r／min，

5min的離心處理，溶液分層后的中間層便是氧合血紅蛋白。抽取500 μL中間層溶液置于4°C保存，用于后續檢測處理。

1.2.2 氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜測定 測定方案參照劉仁明等制備二維納米銀膜的方法［7］，在納米銀膜基底上均勻涂覆制備好的氧合血紅蛋白樣品，涂覆量為60 μL，使其均勻覆蓋在基底上并形成直徑約1 cm的液體薄膜。待其自然干燥后利用美國海洋光學公司生產的便攜式拉曼光譜儀（R?2500TM）進行檢測。NIR?SERS光譜的測定選取了785 nm激光波長，采用垂直照射的方法，參數：激光功率密度J＝103W·cm－2，每次掃描16 s，掃描次數為2次。為了降低實驗誤差，各樣品分別測試三條譜線并取平均值。

1.3 數據處理 數據分析與處理采用的工具包括2007excel、Origin 8.0、SPSS19.0、Raman Spectrum 等。

2 結果

2.1 氧合血紅蛋白NIR-SERS光譜 將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜，對肺癌患者以及健康人進行NIR?SERS光譜檢測分析，每組研究對象的樣本數量均為25名，圖1A為25名健康人氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜，圖1B為25名肺癌患者氧合血紅蛋白NIR?SERS 光譜。

圖1 氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜

將25名健康人（A）和25名肺癌患者（B）氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜求出平直曲線，并將譜線平均值向上／下平移處理，進而獲取到直觀的對比結果。圖2為25名健康人（A）和25名肺癌患者（B）氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜比對，由圖2可知，就氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜分析結果而言，兩組樣品具備明顯差異。相比于健康人，肺癌患者的氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜強度相對較小。 在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－1均出現了兩組研究樣本氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜共有的譜峰；圖中健康人和肺癌患者光譜譜峰強度有明顯區別，相比于肺癌患者，在 662、723、816 cm－1等位置處健康人氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜譜峰強度相對較大；473、816、1583 cm－1處健康人的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜出現的拉曼譜峰較肺癌患者更為明顯。另外，在1583 cm－1處，健康人氧合血紅蛋白平均NIR?SERS 光譜出現藍移現象，藍移至 1579 cm－1，肺癌患者在1208、1425 cm－1處譜峰出現紅移現象，移動至 1212、1432 cm－1。

圖2 25名健康人（a）和25名肺癌患者（b）氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜比對

2.2 t檢驗結果分析 對25名健康人和25名肺癌患者氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜扣除熒光背景，由于光譜中信息主要來自譜峰的相對強度和形狀，故將在400～1800 cm－1范圍內的譜峰進行面積歸一化，面積歸一化可以消除由于實驗條件的微小差異對實驗結果的影響。本實驗采用的面積歸一法就是指把氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜的譜峰面積逐個算出來（采用 Origin作圖軟件計算譜峰面積），如 S1、S2、S3.....Sn，然后把每個譜峰的面積相加得 S 總，再用每個譜峰的面積 S1、S2、S3.....Sn 除以總面積 S 總得到每個譜峰所占的面積比 A1、A2、A3...An，即An＝Sn／S總。表1是 25名健康人和 25名肺癌患者在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－19處譜峰面積的顯著性分析。

通過表1顯著性分析可以看出肺癌患者相對正常人在473 cm－1處譜峰面積 A1和1583 cm－1處譜峰面積A9有所減小，達到顯著水平。肺癌患者相對正常人在816 cm－1處譜峰面積A4明顯減小，達到極顯著水平。對25名健康人和25名肺癌患者在473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－19 處譜峰面積的顯著性分析得出的結果與上述NIR?SERS光譜分析基本吻合，從而更加驗證了上述分析結論。

表1 25 例健康人和 25 例肺癌患者在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－19 處譜峰面積的顯著性分析

3 討論

從表1氧合血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬［9－12］中能夠清晰直觀地了解生物分子變化所導致的肺癌患者血紅蛋白NIR?SERS光譜變化的具體機理，氧合血紅蛋白分子乙烯基團（CaCm）的對稱和反對稱伸縮振動分別是引發處于1425、1583 cm－1附近的拉曼譜峰的根本原因；吡咯環間CmH基團的變形振動是引發處于1208 cm－1附近的拉曼譜峰的根本原因；吡咯半環的反對稱以及對稱伸縮振動分別是引發處于1126、1336 cm－1附近的拉曼譜峰的根本原因。

由圖2可知，相比于健康人而言，在1583、816、473 cm－1處肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜譜峰強度較小，從表2氧合血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬得知上述三個譜峰的產生原因分別為氧合血紅蛋白分子乙烯基團（CaCm）的反對稱和對稱伸縮振動、氧合血紅蛋白吡咯環的對稱和反對稱變形振動、氧合血紅蛋白水合高鐵血紅蛋白吡咯環折疊振動，上述結果的依據為血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬分析結果。肺癌患者的譜峰之所以小于正常人，主要原因是上述三種振動模式數量的減少。另外，由于氧合血紅蛋白吡咯環以及氧合血紅蛋白分子乙烯基團的振動會影響人氧合血紅蛋白平均 NIR?SERS光譜在1583 cm－1的譜峰變化，因此，當肺癌患者新陳代謝紊亂、惡性腫瘤組織異常增大后，其氧合血紅蛋白分子乙稀基團、氧合血紅蛋白吡咯環的構象以及模式往往會產生變化，進而異于健康人的譜峰移動情況［12］。

通過NIR?SERS光譜分析并對比兩組研究對象的氧合血紅蛋白情況，結果表明，兩組樣本氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強度均存在明顯差異。相比于健康人，肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強度均相對較小。對上述現象的內在原理加以分析后發現，肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強度之所以會減小，可能是由于惡性腫瘤組織異常增大所引發的，在這一過程中，患者上皮粘膜組織微血管的增生會直接引發其微血管含氧量的下降，進而誘使腫瘤組織中氧合血紅蛋白含量降低［8］。上述變化能夠通過氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜情況來加以表征。

表2 氧合血紅蛋白的譜峰歸屬［8－11］

在本研究中，將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜，對肺癌患者以及健康人進行NIR?SERS光譜檢測分析。結果顯示，兩組研究對象的NIR?SERS光譜和譜峰強度均具備顯著差異，相比于健康人，在1583、816、473 cm－1處肺癌患者的氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜譜峰強度較小，正常人的氧合血紅蛋白平均NIR?SERS 光譜在 1208、1425 cm－1譜峰處肺癌患者分別紅移至1212、1432 cm－1，通過對氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜分析，觀察到健康人在1583 cm－1的譜峰藍移到1579 cm－1。上述譜峰均與氧合血紅蛋白吡咯環和乙烯基團（CaCm）的振動有關。對于肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強度減小。因此通過肺癌組和對照組的譜峰強度變化揭示了氧合血紅蛋白NIR?SERS用于診斷肺癌的潛力。利用氧合血紅蛋白的NIR?SERS進行肺癌或其他疾病的診斷是一項簡單快捷、生物兼容性好的技術，從一定程度上來講，NIR?SERS技術具備應用于肺癌或其他疾病臨床診斷領域的潛力與價值。

［1］Cerfolio RJ，Bryant AS，Ojha B.Restaging patients with N2 （stageⅢa） non?small cell lung cancer after neoadjuvant chemoradiothera?py：a prospective study［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2006，131（6）：1229－1235.

［2］Liu Y，Wang M.Advances in early diagnosis of lung cancer［J］.Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2011，14（5）：429－434.

［3］Lee SM，Park CM，Paeng JC，et al.Accuracy and predictive fea?tures of FDG?PET ／CT and CT for diagnosisof lymph node metastasis of T1 non?small?cell lung cancer manifesting as a subsolid nodule［J］.Eur Radiol，2012，22（7）： 1556－1563.

［4］劉振華，徐美金.惡性腫瘤研究的現狀和對策［J］.人民軍醫，2002，45（5）：269－270.

［5］Liu R，Xiong Y，Tang W，et al.Near?infrared surface?enhanced Ramanspectroscopy （NIR?SERS） studieson oxyheamoglobin（OxyHb） of liver cancer based on PVA?Ag nanofilm［J］.J Raman Spectrosc，2013，44（3）： 362－369.

［6］Feng SY，Pan JJ，Wu YA，et al.Study on gastric cancer blood plasma based on surface?enhanced Raman spectroscopy combined with multivariate analysis ［J］.Sci China Life Sci，2011，54（9）：828－834.

［7］劉仁明，自興發，武延春，等.二維納米結構銀膜表面增強拉曼散射基底的制備與研究［J］.中國激光，2009，36（10）：2657－2661.

［8］Jain RK.Determinants of Tumor Blood Flow：A Review ［J］.Cancer Res，1988，48（10）：2641－2658.

［9］Abe M，Kitagawa T，Kyogoku Y.Resonance Raman spectra of octa?ethylporphyrinato?Ni（II） and meso?deuterated and 15N substituted derivatives.II.A normal coordinate analysis［J］.J Chem Phys，1978，69（10）：4526－4534.

［10］Hu S，Smith KM，Spiro TG.Assignment of Protoheme Resonance Raman Spectrum by Heme Labeling in Myoglobin［J］.J Am Chem Soc.，1996，118（50）：12638－12646.

［11］Geβner R，Winter C，R?sch P，et al.Identification of biotic and abiotic particles by using a combination of optical tweezers and in situ raman spectroscopy［J］.Chem Phys Chem，2004，5（8）：1159－1170.

［12］Yammoto T，Palmer G.The valence and spin state of iron in oxyhem?oglobin as inferred from resonance Raman spectroscopy［J］.J Biol Chem，1973，248（14）：5211－5213.