梗阻性腎病腎組織中磷酸化黏著斑激酶的表達及意義*

陳志，李冰晟，何垚，王朝暉，張波，杜勇超，劉雨杭，陳湘

（中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008）

腎間質纖維化是梗阻性腎病最顯著的病理學特征[1-3]，探討梗阻性腎病引起腎間質纖維化的可能機制和靶點對于梗阻持續存在的情況下如何保護腎功能、在梗阻解除后如何減緩腎間質纖維化、對其他病因腎病的治療具有意義[1，4-7]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）可以作為跨膜蛋白亞基整合素β1的胞內連接酶發生自身磷酸化（pFAK）而被激活[8-10]，而FAK的下游涉及與纖維化過程相關的多條通路，且由于FAK介導多種臟器纖維化[11]，筆者推測FAK可能在梗阻性腎病腎間質纖維化中發揮作用。肌成纖維細胞的形成被認為是腎間質纖維化的關鍵環節，而α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）作為肌成纖維細胞的標志物[12]，在腎間質纖維化研究中被廣泛關注[13-14]。本研究通過復制單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）的SD大鼠模型，并檢測不同時間模型組及假手術組大鼠腎臟中pFAK的表達，及與整合素β1、α-SMA的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

健康雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性SD（Sprague Dawley）大鼠18只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），體重200～220 g，寄養于中南大學實驗動物學部SPF級屏障設備內。溫度（22±2）℃，相對濕度（55±2）%，明暗交替12/12 h。大鼠自由攝取水及飼料。大鼠適應性飼養1周后，隨機分為假手術組、3 d模型組及14 d模型組3組，每組6只。在所有的實驗操作過程中，遵循實驗動物的使用原則。

1.2 復制動物模型

模型組行單側輸尿管結扎術：大鼠適應性飼養1周后開始建模，禁食24 h后，以5%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射將大鼠麻醉，以俯臥位固定于大鼠手術臺，局部剃毛備皮，皮膚消毒，選擇左側背部脊柱旁0.8 cm腎區縱行切口，依次切開各層組織至腹內，游離腎臟、輸尿管，將左側輸尿管用玻璃分針挑起，用雙絲線結扎左側輸尿管上段靠近腎盂處，于兩線之間剪斷輸尿管。均勻噴涂慶大霉素后依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚，絡合碘消毒皮膚，酒精拭去切口周圍血漬。在手術后，密切關注各組小鼠的情況變化。假手術組：手術入路方式同模型組，游離出左側輸尿管后不結扎。在手術后，密切關注各組小鼠的情況變化。假手術組假手術操作14 d后，2個模型組分別在大鼠輸尿管結扎術后3 d和14 d后處死。

1.3 指標檢測

1.3.1 免疫組織化學（簡稱免疫組化）檢測pFAK、整合素β1（CD29）、α-SMA 設計不同的時間處死大鼠，切取左側腎臟組織，一部分10%多聚緩沖甲醛溶液固定24 h，制備切片，免疫組化檢測CD29，pFAK，α-SMA的表達。石蠟切片脫蠟去水后滴加適量的胰酶稀釋液，置于37℃恒溫箱中30 min行抗原修復。PBS液充分洗滌后將切片置入3%過氧化氫溶液，室溫及避光下孵育25 min，阻斷內源性過氧化物酶。均勻地滴加用3% BSA覆蓋組織，室溫下封閉30 min。在切片上滴加PBS與按一定比例配好的一抗，濕盒內4℃孵育過夜。后將玻片洗滌后滴加與一抗，相應種屬的二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50 min。洗滌甩干后在滴加DAB顯色液顯色。Harris蘇木素復染細胞核后脫水封片。用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0進行分析，根據公式累計光度值/像素點=平均光密度值（optical density, OD），計算OD值，比較各組差異。

1.3.2 Western blot檢測 CD29、pFAK、α-SMA 左側腎臟皮質，一部分放置入凍存管中，液氮保存，利用WB法分別檢測假手術組，3 d、14 d模型組的表達情況。組織塊用PBS洗滌后剪成小塊勻漿，轉移離心管振蕩并冰浴30 min。11 372 r/min離心10 min，收集上清為樣品。BCA法測蛋白濃度后電泳，每孔加50 ng蛋白樣品電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓150 V。電泳結束后轉膜，300 mA恒流轉膜0.5 h或25 V恒壓轉膜過夜，將轉有蛋白的膜置于5% BSA封閉1 h后，置于Ⅰ抗（CD29，pFAK，α-SMA抗用封閉液1∶1 000稀釋，GAPDH作內參照按1∶5 000稀釋）中，置4℃冰箱中振蕩過夜，1×TBS洗3次，每次10 min。置HRP標記的Ⅱ抗（用封閉液1∶5 000稀釋）中孵育2 h，1×TBS洗3次，每次10 min，將ECL-A及ECL-B 1∶1體積比混合，與膜孵育3 min后，吸盡殘液，保鮮膜將膜包裹完全，置入暗匣內曝光。使用顯影和定影試劑顯影和定影。將曝光的底片進行掃描并導出保存圖片，圖像處理軟件整理去色，以GAPDH作為內參，Alpha軟件處理系統計算分析目標帶的光密度值。條帶相對灰度值=目的條帶灰度值/同個樣品GAPDH灰度值。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，變量的相關性用Linear correction分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組CD29、pFAK、α-SMA的染色及OD值比較

免疫組化檢測結果顯示，α-SMA的表達主要在間質，而pFAK及CD29在腎小管上皮細胞及間質均有表達，見圖1～3。隨著建模時間的延長，pFAK、CD29及α-SMA表達量逐步升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組pFAK、α-SMA及CD29的蛋白表達情況

假手術組腎組織pFAK、α-SMA及CD29表達量低，隨著建模時間的延長，pFAK、CD29及α-SMA表達量逐步升高，差異有統計學意義（FpFAK=45.398，PpFAK=0.000；FCD29=23.713，PCD29=0.000；Fα-SMA=43.428，Pα-SMA=0.000）。各組間pFAK、α-SMA及CD29兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖4和表2。

2.3 各組pFAK與α-SMA和CD29的相關性

pFAK與α-SMA成正相關，差異有統計學意義（r=0.852，P=0.000），pFAK與CD29呈正相關，差異有統計學意義（r=0.800，P=0.000）。見圖5、6。

圖1 各組腎臟組織pFAK的表達 （×400）

圖2 各組腎臟組織CD29的表達 （×400）

圖3 各組腎臟組織α-SMA的表達 （×400）

表1 各組pFAK、CD29、α-SMA表達的OD值 （n=6，±s）

表1 各組pFAK、CD29、α-SMA表達的OD值 （n=6，±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與UUO 3 d模型組比較，P＜0.05

pFAK CD29 α-SMA假手術組 0.001 3±0.000 4 0.001 0±0.0010 0.002 1±0.001 0 3 d模型組 0.004 2±0.000 41）0.003 2±0.00081）0.009 0±0.002 01）14 d模型組 0.007 8±0.000 52）0.018 3±0.00222）0.019 4±0.001 42）組別

圖4 各組腎臟組織CD29、pFAK、α-SMA的蛋白表達

圖5 pFAK與α-SMA的相關性

圖6 pFAK與CD29的相關性

表2 各組腎臟組織CD29，pFAK，α-SMA的蛋白表達（n=6，±s）

表2 各組腎臟組織CD29，pFAK，α-SMA的蛋白表達（n=6，±s）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與3 d模型組比較，P＜0.05

組別 pFAK CD29 α-SMA假手術組 1 1 1 3 d模型組 7.02±3.591）3.00±0.661）8.52±4.511）14 d模型組 16.29±3.262）7.07±2.612）22.21±5.252）

3 討論

FAK是一種酪氨酸激酶，被磷酸化以后活化。FAK可與整合素β1或作為細胞因子受體RTKs（受體酪氨酸激酶）下游激酶在Tyr397位點被磷酸化，進而激活其他的磷酸化位點[15]。Tyr397磷酸化的FAK可以與多種含SH2結構域的蛋白質分子相結合，如src家族、細胞信號抑制因子、生長因子連接蛋白、多種激酶等，從而產生各種生物學效應[16]。

本實驗通過體內實驗UUO大鼠模型發現梗阻性腎病腎組織pFAK表達升高，且隨處理時間增加而升高。且發現在梗阻性腎病腎間質纖維化模型中pFAK的表達與α-SMA表達呈正相關。α-SMA是ACTA2基因編碼的蛋白質，是參與細胞運動，結構和完整性的高度保守的蛋白質[17]。肌成纖維細胞的生成是纖維化過程的重要環節，研究顯示肌成纖維化能力是成纖維細胞的4～6倍，而α-SMA通常被看成肌成纖維細胞形成的標志物[12]。本實驗通過體內實驗UUO大鼠模型發現梗阻性腎病腎組織α-SMA表達升高，且基本趨勢為隨處理時間增加而升高，從免疫組化圖片可看到α-SMA主要表達于腎小管周圍間質，這些均與現有研究一致，輔證造模成功，及梗阻性腎病的確存在肌成纖維細胞生成增加這一纖維化過程中的重要環節。而在梗阻性腎病腎間質纖維化模型中pFAK的表達與α-SMA表達呈正相關，提示FAK在在梗阻性腎病腎間質纖維化過程中發揮促進作用，有可能是通過促進形成肌成纖維細胞而發揮作用。

通過相關性分析，同樣發現在梗阻性腎病腎間質纖維化模型中pFAK的表達與整合素β1（CD29）表達呈正相關。整合素是廣泛的細胞表面黏附和信號分子，由α-亞基和β-亞基組成，將細胞內骨架連接到細胞外基質，并雙向跨膜傳遞信號。在整合素家族成員中，整合素β1是最關鍵的，因為整合素β1可以與不同α亞基配對，使其成為不同刺激因子的受體。整合素β1可以作為力傳感器，將機械刺激轉化為生化信號[18]。在正常條件下，整合素對維持細胞內穩態至關重要，可以啟動多條信號通路，其中一些信號通路主要與細胞遷移和細胞黏附相關，而另一些信號傳遞調節細胞分化、增殖、存活和凋亡。整合素β1介導細胞外基質合成，纖維化相關細胞轉化激活[18-19]，與包括阻塞性腎病等不同病因所致多種腎臟纖維化有關[20-22]。逆行壓力增加引起的腎小管上皮及間質細胞的機械拉伸在阻塞性腎病過程中被認為是非常顯著的，本研究顯示UUO模型中整合素β1表達上調，且在梗阻性腎病腎間質纖維化模型中pFAK的表達與整合素β1表達呈正相關，結合文獻，提示FAK可能是作為整合素β1的下游[10-11]，在梗阻性腎病腎間質纖維化過程中發揮促進作用。