球周注射尼莫地平對兔慢性高眼壓致視網膜神經節細胞凋亡的干預作用

黃帥，張新躍，張雅馨，劉穎，李琰，周亞男，王林洪

（華北理工大學附屬醫院 眼科，河北 唐山 063000）

青光眼是繼白內障之后的第二大致盲性疾病，研究顯示全球青光眼患病量在2040年將達11 180萬[1]。青光眼的視神經損害主要表現在視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell, RGC）的凋亡，多種研究顯示青光眼的發病類似于老年癡呆、帕金森等中樞退行疾病，首先病變可能起始于中腦上丘，進一步發展至RGCs，最終引起1個投射單位的凋亡[2-3]。因此，劉光旭等[4]認為青光眼屬于中樞神經系統疾病，在降眼壓的同時，對視神經的保護成為治療重點。眾所周知，鈣通道阻滯劑（calcium channel blockers, CCB）作為中樞神經保護藥物應用臨床已有多年[3]，與其他CCBs相比尼莫地平（nimodipine, NMD）具有高脂溶性，可以輕易跨過血-腦屏障，對中樞神經系統具有較高親和力，能阻斷鈣離子內流，保護神經元[5]。但相關研究顯示，尼莫地平口服給藥生物利用率相對較低，只有4%～13%[6]。在神經外科，較多學者通過大量動物實驗及毒理實驗證實局部給藥是安全有效的，支持NMD通過蛛網膜下腔[7]、腦室[8]及皮下注射等[9]途徑給藥，認為局部給藥即可避免全身給藥的低血壓等并發癥，也可在局部達到有效的藥物濃度，提高治療效果[7-9]。本研究擬通過尼莫地平注射液球周注射的方法，進一步評估尼莫地平局部高濃度對慢性高眼壓兔視網膜損傷的保護作用，及局部注射對眼外肌等眶內組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭白兔30只（由華北理工大學動物實驗中心提供），體重2～2.5 kg，雄性，普通級實驗動物，外眼及眼底無異常。適用性喂養1周，隨機分成5組，每組6只，右眼為實驗眼，實驗前3 d開始點抗生素滴眼液，每日3次。

1.2 主要實驗材料

卡波姆940（美國諾譽），Tono-pen AVIA眼壓計（美國Mentor公司），B淋巴細胞瘤2基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴細胞瘤2基因相關蛋白X（BCL2-Associated X, Bax）兔單克隆抗體/免疫組織化學（簡稱免疫組化）試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），TUNEL試劑盒（美國ROCHE藥業），尼莫地平注射液（尼膜同，德國拜耳醫療）。

1.3 方法

1.3.1 制備卡波姆溶液 卡波姆及地塞米松注射液溶入無菌注射用水中，配置成3 g/L復方卡波姆（含地塞米松0.25 g/L）。

1.3.2 復制慢性青光眼模型 A組為正常組不做任何處理。其余放入兔盒內限制自由活動，雙眼點表面麻醉藥2次，間隔3 min。眼壓計連續測量3次，取平均值，計兔基礎眼壓。采用“隧道”法復制慢性青光眼模型即：5 ml注射器針頭，自右眼11點方向角膜緣后1 mm處進針，角度約15°，角膜緣層間走行約1～2 mm自透明角膜進入前房，待針頭尾端可見前房液時，退出5 ml注射器針頭，淚道沖洗針頭自穿刺口進入前房瞳孔區，緩慢推注0.2 ml卡波姆溶液。術眼滴入1滴洛美沙星眼用凝膠。注入后逐漸出現球結膜充血，角膜霧狀混濁，術后3 h測量眼壓，均超過2.93 kPa，可見前房輕度加深，瞳孔豎橢圓形。第1周每日測量眼壓，以后每3～4天測量眼壓1次。慢性高眼壓模型眼壓維持在2.93～6.67 kPa。對眼壓低于2.93 kPa者給予補充卡波姆溶液0.1 ml。B組為對照組，給予生理鹽水1 ml球周注射，C、D、E為NMD低、中、高劑量組，分別球周注射NMD注射液0.25 ml（0.125 mg）+生理鹽水0.75 ml和0.5 ml（0.25mg）+生理鹽水0.5 ml及1 ml（0.5 mg），每日 1 次。

1.4 標本的制備

每組于治療2周時處死動物，100 g/L水合氯醛耳緣靜脈麻醉，右眼點丙美卡因滴眼液2次，迅速取材，分離眼外肌，摘取眼球，40 g/L多聚甲醛中固定30 min，自角膜緣剪去角膜，去除晶狀體，繼續固定24 h以上；將眼球壁自視乳頭處縱向切開，于距視乳頭旁0.3 cm以外，沿視神經水平和垂直方向各取約1.0 cm×0.5 cm的視網膜組織。均放入包埋盒中，經脫水、透明、石蠟包埋、切片，分別行HE染色、TUNEL檢測及免疫組化檢測Bcl-2、Bax表達量。

應用相關試劑盒說明操作，放置顯微鏡下計數，計數方法：每只眼球隨機選取2個200倍視野，計數陽性細胞數及總細胞數，計算陽性表達率。陽性表達率=陽性細胞數/細胞總數×100%。視網膜神經節細胞凋亡指數按照TUNEL試劑盒說明操作，凋亡細胞的細胞核呈棕色或棕褐色，放置顯微鏡下計數，計數方法同上，計算凋亡指數，凋亡指數=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，所得數據行滿足方差分析條件（正態分布/方差齊性）的檢驗。多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonfereoni校正的t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

復方卡波姆溶液注入兔前房，兔眼壓逐漸升高，在3 h及達到2.93 kPa，約于第3天達到峰值，可以維持在2.93 kPa以上2周。剔除眼壓超過50 mmHg、角膜擴張等未完成實驗者。

2.1 各組視網膜病理切片情況

A組（正常組）可見視網膜各層次清晰，細胞核排列緊密。B組（對照組）可見視網膜水腫，神經節細胞數量減少，內外核層排列疏松、紊亂。治療組C、D、E組上述改變較B組減輕，以D、E組損傷最輕。見圖1。

2. 2 Bcl-2蛋白表達

視網膜可見Bcl-2表達于細胞漿，染色呈黃色或棕黃色，主要位于RGCs層及內核層。正常視網膜無Bcl-2陽性表達A組（見圖2A）。在B、C組（見圖2B、2C）呈低表達，在D、E兩組（見圖2D、2E）呈高表達。

2.3 Bax蛋白表達

Bax陽性表達于細胞漿，顏色呈黃色或棕黃色。Bax在A組（見圖3A）正常視網膜無Bax陽性表達。在B、C兩組（見圖3B、3C）呈高表達，隨著NMD劑量增高陽性細胞表達量降低，在D、E兩組（見圖3D、3E）呈低表達，隨著NMD劑量的增加，Bax表達量逐漸減緩。

圖1 各組視網膜病理切片 （HE×50 μm）

圖2 各組視網膜Bcl-2表達 （50μm）

圖3 各組視網膜Bax表達 （50μm）

2.4 視網膜神經細胞凋亡指數

按照TUNEL試劑盒說明書操作，陽性細胞主要表達于細胞核，染色呈棕色或棕褐色。在正常視網膜無陽性細胞表達A組（見圖4A）。在B、C兩組（見圖4B、4C）呈高表達，在D、E組（見圖4D、4E）呈低表達。NMD可降低細胞凋亡TUNEL檢測的表達量，在NMD 0.25 mg時達最低表達點，結果與Bax表達量相符。見附表。

圖4 各組視網膜神經節細胞凋亡 （50μm）

附表 視網膜凋亡相關因子及神經細胞凋亡指數比較 （n=6，±s）

附表 視網膜凋亡相關因子及神經細胞凋亡指數比較 （n=6，±s）

注：1）與B組比較，P＜0.05；2）與C組比較，P＜0.05；3）與D組比較，P＜0.05

組別 Bcl-2/% Bax/% Bcl-2/Bax 神經細胞凋亡指數/%A 組 0.227±0.411 0.606±0.707 0.333±0.188 0.303±0.447 B 組 8.257±1.253 18.560±1.955 0.451±0.093 17.954±1.556 C組 9.545±1.4241）18.905±1.781 0.521±0.085 16.893±1.3681）D 組 18.257±1.4221）2）11.075±1.1271）2）1.833±0.2571）2）9.696±0.9751）2）E 組 19.621±1.8371）2）3）9.015±0.9051）2）2.196±0.2961）2）3）8.939±0.9361）2）F值 413.244 350.815 77.669 481.958P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

尼莫地平屬于第2代二氫吡啶類鈣拮抗劑，具有脂溶性高，溶解度低，可以透過血-腦屏障、胎盤屏障等生理屏障[9]，已在臨床廣泛應用。1998年PILTZ[10]最早應用于正常眼壓性青光眼（normal tension glaucoma,NTG）患者100例，通過對視野范圍和視敏度及視力的觀察，表明尼莫地平對NTG患者具有一定療效。隨后相似的研究進一步觀察NTG的視網膜血液循環，表明NMD改善了NTG患者的視網膜血液循環[11]。大量的實驗室也證實NMD具有保護神經節細胞，減少凋亡發生[12]。但臨床的病例對照性研究中似乎并不是那么理想，因為口服給藥需經過消化道吸收[7]，其口服生物利用度低。NMD對神經外科蛛網膜下腔出血早期給藥可以減少腦血管痙攣的發生。H?NGGI[8]通過制備尼莫地平-聚乙二醇（Nimodipine-poly（DL-lactide-co-glycolide）, PLGA）懸液，將極低劑量的NMD-PLGA注入小鼠和狗腦池內，分別檢測29 d血清和腦脊液，取得持久的NMD濃度，也通過對SAH模型狗的治療，降低了腦血管痙攣的發生。該緩釋制劑減少靜脈給藥所引起的低血壓等并發癥的發生，也避免口服給藥較低的生物利用度[8]。球周注射給藥是眼科常用的并熟練掌握的給藥途徑，可以在眼內及局部達到有效、穩定的藥物濃度，是口服給藥難以達到的，也是靜脈給藥難以保障的。本實驗顯示，尼莫地平注射液球周注射，具有較好的RGCs保護作用。

細胞凋亡是凋亡基因控制下發生的，研究最廣泛的Bcl-2是抑制凋亡基因，Bcl-2/Bax比值對細胞凋亡發生與否起決定性作用。本研究顯示，Bcl-2在各組間有差異，NMD可以上調Bcl-2因子的表達，而保護RGCs的凋亡。Bax表達量在B、C兩組呈高表達，而在D、E兩組呈低表達，D、E兩組與B、C兩組比較有差異，證實NMD可以通過下調Bax表達抑制凋亡。在3種劑量之間，低劑量與中、高劑量比較有差異，而中高劑量比較無差異，該點與TUNEL檢測結果與此相似，即D、E兩組陽性細胞表達量P＞0.05，提示NMD在0.25 mg時便可發揮有效的保護作用，增加劑量并不能抑制凋亡的發生，可能的機制是NMD抑制鈣離子內流的能力和細胞外鈣離子內流的趨向力存在一定濃度差，當大于這一差值時鈣離子內流難以抑制。本實驗未給予更高濃度的劑量，該劑量相關性的上限并未顯示。一但凋亡機制啟動，凋亡將可能不可避免的發生。

實驗顯示，采用NMD注射液球旁注射對慢性青光眼兔RGCs具有保護作用，可能通過抑制鈣離子內流上調Bcl-2表達，下調Bax表達。NMD球周注射還可以通過增加眶內段視神經周圍的藥物濃度，通過軸漿運輸到達中腦上丘。

青光眼的神經保護是從視路性疾病的角度出發，目前研究認為CCBs在中樞神經系統無論是外傷性及退行性變是有積極意義的[12]。本實驗NMD球周注射向臨床治療提供新的思路，局部高濃度的NMD是神經保護的重要條件，但多次注射仍會受到限制，未來緩釋系統的研發將會降低注射的次數，這將會使NMD眼局部給藥成為理想的給藥途徑。