泰克地那林對四氯化碳誘導小鼠急性腎損傷的治療作用*

程樹林，胡春燕，朱平宇，周文浩，龔志勇

（川北醫學院附屬醫院 泌尿外科，四川 南充 637000）

急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）是臨床常見的危急重癥[1-2]，其發病率逐年上升，是導致患者死亡的重要原因。組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases, HDACs）是一類調控染色質結構的蛋白酶，既往研究主要集中在神經退行性疾病、衰老相關疾病、糖尿病、心血管疾病以及腫瘤，證實HDACs抑制劑具有抗炎、抗纖維化和抗腫瘤作用[3]。而最近研究表明，HDACs調控在腎損傷應答過程中起重要作用[4-5]。廣譜性HDAC抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）、丙戊酸（valproic acid, VPA）已被證實具有一定的急性腎損傷修復作用，但也存在藥效不穩定、副作用較強等局限性[6-7]。泰克地那林（Tacedinaline, CI994）是一種I類HDAC特異性抑制劑，主要作用于HDAC1、2、3[8]，其對急性腎損傷是否具有治療作用目前尚未可知。本研究采用特異性HDAC抑制劑CI994代替廣譜性抑制劑，通過構建四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）誘導小鼠急性腎損傷模型，觀察CI994對小鼠腎損傷的影響，探究其潛在的治療性價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

無特定病原體（SPF）級雄性小鼠40只，體重25～30 g，購自川北醫學院實驗動物中心（本研究符合川北醫學院實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準）；CCl4（川東化工），食用橄欖油（RONGS，西班牙），CI994（Selleck），尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、肌酐（serum creatinine, Scr）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）測定試劑盒（南京建成），胱抑素C（cystatin C,Cys C）ELISA試劑盒（美國），小鼠腎損傷分子1（kidney injury molecular 1, KIM-1）ELISA試劑盒（上海瓦蘭）。CCl4與橄欖油按照1∶9的體積比例配置成10% CCl4溶液。CI994溶于DMSO，配置成200 mmol/L濃度，并用生理鹽水配制成最終濃度4 mmol/L（約1.08 mg/ml）。

1.2 CCl4誘導小鼠急性腎損傷模型的復制

參照KOICHIRO SUZUKI等的實驗方法建立CCl4誘導小鼠急性腎損傷模型[9]。將小鼠隨機分為4組，對照組：一次性腹腔注射300 μl生理鹽水；藥物對照組：在腹腔注射等體積生理鹽水6 h后腹腔注射CI994，注射劑量為10 mg/kg，24 h后再次注射等劑量CI994；CCl4造模組：按20 ml/kg體重的劑量一次性腹腔注射10% CCl4溶液；CI994治療組：在CCl4給藥后6和24 h分別腹腔注射CI994，注射劑量為10 mg/kg[10]。于給藥CCl4后48 h通過提尾法收集尿液，然后腹腔注射麻醉后處死小鼠，心臟采集全血，不加抗凝劑靜置2 h，離心并收集血清。開腹收集腎組織標本進行包埋固定或者液氮冷凍保存。

1.3 腎功能指標檢測

用7600全自動生化分析儀測定血清BUN、Scr，采用ELISA法測血清Cys C、尿液KIM-1水平。具體方法參照試劑盒說明書。

1.4 組織勻漿及MDA、SOD含量檢測

取腎組織0.75 g，用剪刀剪碎后加20倍干重體積的0.05 mol/L預冷PBS緩沖液在勻漿機內勻漿，制成5%腎勻漿。參照試劑盒說明書，采用7600全自動生化分析儀測定MDA水平和SOD活性。

1.5 腎臟組織HE染色

取小鼠完整左腎組織固定于10%中性甲醛溶液48 h，經脫水、透明和包埋，制成腎組織石蠟塊。石蠟包埋切片，行HE染色鏡下觀察腎組織病理改變。

1.6 組織mRNA提取以及細胞色素2E1（CYP2E1）表達水平檢測

取適量-80℃保存的腎臟組織，采用Trizol法提取總RNA，經逆轉錄后合成cDNA，采用SYBR法行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測細胞色素2E1（cytochrome P450 2E1, CYP2E1）mRNA水平。檢測所用的小鼠CYP2E1引物序列：正向AGAGACCACCA GCACAACTC，反向TTCATCCTGTCTCGGACTGC。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清的BUN、Scr和Cys C水平比較

各組小鼠血清的BUN、Scr和Cys C水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（BUN：F=66.594，P=0.000；Scr：F=181.818，P=0.000；Cys C：F=82.059，P=0.000）。藥物對照組與對照組BUN、Cys C等指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，CCl4造模組小鼠注射CCl448h后BUN、Scr和Cys C均升高（P＜0.05）。通過CI994治療各組指標均有一定程度回落，與CCl4造模組和對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠腎功能指標的比較（n=10，±s）

表1 各組小鼠腎功能指標的比較（n=10，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與CCl4造模組比較，P＜0.05

組別 BUN/（mg/dl） Scr/（mg/dl） Cys C/（mg/L）對照組 21.78±2.02 0.599±0.097 3.818±0.202藥物對照組 20.65±3.42 0.712±0.156 4.123±0.325 CCl4造模組 93.64±9.371）3.624±0.2791）14.379±2.9121）CI994 治療組 60.36±5.721）2）2.354±0.1761）2）9.213±1.0551）2）F值 66.594 181.818 82.059P值 0.000 0.000 0.000

2.2 各組小鼠尿液KIM-1含量比較

各組小鼠尿液KIM-1含量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=152.279，P=0.000）。與對照組比較，藥物對照組尿液KIM-1含量差異無統計學意義（P＞0.05），CCl4造模組小鼠注射CCl448 h后KIM-1升高（P＜0.05），經CI994治療小鼠KIM-1有一定程度降低，但仍然高于對照組（P＜0.05）。見圖1。

2.3 腎組織形態學變化

對照組和藥物對照組腎小球、腎小管結構正常。CCl4造模組可見腎小管上皮細胞變性，腎小管囊腔緊縮，空泡樣變化明顯，細胞腫脹、壞死和脫落；腎小球和微血管中大量淤血，甚至腎小管中亦有滲血情況；腎小球萎縮退化，腎間質炎癥細胞浸潤；CI994治療組腎臟仍然存在空泡樣變、腎小球和微血管中淤血、腎小管細胞腫脹等情況，但損傷程度均較造模組輕，見圖2。

2.4 腎組織MDA含量和SOD活性比較

4組MDA和SOD變化差異有統計學意義（MDA：F=65.735，P=0.000；SOD ：F=13.272，P=0.000）。藥物對照組相與對照組MDA和SOD比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。CCl4造模組MDA和SOD與對照組比較升高（P＜0.05），經過CI994治療后，MDA和SOD降低（與CCl4造模組和對照組比較，P＜0.05），見表2。

2.5 各組小鼠CYP2E1 mRNA表達水平比較

各組小鼠腎組織CYP2E1的mRNA表達水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=45.642，P=0.000）。CCl4造模組CYP2E1 mRNA表達水平在腎臟中相對于對照組升高（P＜0.05），而CI994治療組CYP2E1 mRNA表達水平降低（與對照組和CCl4造模組比較，P＜0.05）。見圖3。

圖1 4組小鼠尿液Kim-1含量的變化

圖2 4組小鼠腎組織病理改變 （×200）

表2 CI994對各組小鼠腎組織MDA含量和SOD活性的影響

圖3 4組小鼠腎組織CYP2E1 mRNA表達水平的變化

3 討論

腎臟作為機體主要的排泄器官，是多種藥物的代謝場所，亦是最容易受到毒性損傷的器官。其功能受損會導致體內代謝終產物堆積，典型標志為尿素氮和肌酐水平上升50%以上[11]。本研究分析CI994對于CCl4介導的小鼠急性腎損傷的治療作用，結果顯示CCl4誘導的小鼠腎損傷進程受到CI994的阻斷，提示CI994是一種理想的急性腎損傷治療藥物。

四氯化碳作為一種典型的親肝毒物，對腎臟亦具有強烈的毒性損傷效應[12]。CCl4作用于肝臟中產生的自由基（如CCl3-和CCl3O2-），通過血液進入腎臟，并攻擊腎小管、腎小球細胞膜上的磷脂分子，引起脂質過氧化反應，進而發生急性腎損傷[13]。因此，CCl4模型常用于探索藥物性腎損傷發病機制和評估抗腎損傷藥物的藥效等實驗研究。大鼠實驗中證實CCl4誘導急性腎損傷后導致腎臟活性氧反應出現紊亂，磷脂氫過氧化物、血清和腎組織MDA均升高[14]。本研究中，造模小鼠經腹腔注射CCl4后出現精神萎靡、動作遲緩等癥狀；同時血清中尿素氮和肌酐增高，CYP2E1在腎組織中出現表達上調；光學顯微鏡下腎小球萎縮退化，近端小管上皮細胞變性壞死；尿液中KIM-1含量升高，提示CCl4對小鼠同樣造成嚴重的腎損傷，表明造模組小鼠表出現典型的急性腎功能衰竭癥狀。

組蛋白去乙?；敢种苿┚哂锌估w維化、抗炎、抗氧化的作用并參與調控多種疾病的發生、發展。ADVANI等研究小鼠糖尿病模型時發現SAHA可通過減少體內活性氧產物的方式改善腎臟的損傷[6]。李瑞芳和Katrienvan Beneden分別通過復制腎性高血壓大鼠腎臟纖維化模型和小鼠阿霉素腎病模型并使用組蛋白去乙?；敢种苿┨幚頃r發現丙戊酸鈉（VPA）可有效降低大鼠和小鼠的腎損傷程度[7，15]。汪麗等證實SAHA可通過下調OPN、CD44表達，降低氧化應激水平等機制預防腎結石形成和減弱腎損傷程度[16]。SAHA和VPA均為廣譜性HDAC抑制劑，但其也存在較大局限性，如藥效不穩定、副作用較強等[17]。本研究基于國內外研究，采用CI994這種Ⅰ類HDAC特異性抑制劑對腎損傷的作用做進一步的探討。CI994是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，可同時抑制HDAC1、2和3的去乙?；δ躘6]，并通過上調生長抑素受體亞型2（somatostatin receptor subtype 2, SSTR2）抑制腫瘤細胞增殖[18]。本研究中，在CCl4誘導小鼠腎損傷并給予CI994腹腔注射后，其血清BUN、Scr以及尿液KIM-1下降，說明CI994對腎損傷有著抑制作用。并且實驗進一步發現腎臟中MDA含量隨著CI994的使用而呈下降趨勢，SOD活性成上升趨勢，提示CI994可能通過調控組蛋白乙?；酱龠M細胞氧化損傷修復從而促進細胞對CCl4毒性的代謝。

細胞色素CYP2E1是肝腎等組織中特異性表達的氧化損傷應答關鍵因子之一，其在藥物損傷過程中表達水平急劇上升，并導致細胞內氧化應激反應異常升高[19]。WANG等通過實驗證實抑制CYP2E1表達可通過抑制催化鐵的釋放、降低活性氧簇（ROS）的生成，從而有效減輕急性腎損傷程度[20-21]。本研究中，CCl4介導小鼠急性腎損傷期間，CYP2E1 mRNA表達水平急劇上升、SOD活性下降均提示胞內活性氧成分積累過度，細胞損傷嚴重。通過給藥CI994后，CYP2E1 mRNA表達水平下降，同時腎功能相關指標如BUN、Scr等均出現回降趨勢，提示CI994對CCl4介導的小鼠急性腎損傷的治療性作用機制可能是通過降低CYP2E1表達而實現。

綜上所述，CI994對腎損傷具有治療性作用，相關機制可能與Ⅰ相毒物代謝蛋白CYP2E1的表達下調有關。這對防治急性腎損傷或許有良好的應用前景，但關于HDAC抑制劑減輕損傷的具體機制仍有待進一步闡明。