一種用于細胞成像檢測Al(Ⅲ)的高選擇性開關型煙酰肼類熒光探針

張曉梅 ，王冠元 ，韓 靜 ，孫予璇 ，李慶忠 ，謝承志

（1.天津醫科大學藥學院，天津300070；2.天津醫科大學腫瘤醫院藥學部,天津300060；3.煙臺大學化學化工學院，煙臺264005）

鋁是地球上含量最多的金屬元素，在生產生活領域中有著廣泛的應用，如水處理、食品添加劑、藥品、電化學、輕合金的生產等[1-3]。然而，過量的鋁會引起人體特定組織和細胞的損害，導致健康問題，如低色小紅細胞性貧血、鋁相關性骨骼疾病(ARBD)、腦病、癡呆、肌肉病變、阿爾茨海默癥和帕金森病等[4-6]。另外，鋁離子還會產生生物代謝性的危害，如鋁離子會影響體內的鈣和硒的吸收代謝[7]。此外，人們認為，世界上近40%的酸性土壤是由鋁毒污染的，這是妨礙植物（如農作物）在酸性土壤中生長的關鍵因素[8]。選擇性識別和檢測鋁離子，對生物學和臨床醫學等領域的相關研究具有十分重要的意義。熒光探針分析法具有選擇性好、靈敏度高以及操作簡單等優勢，因此設計合成特異性識別鋁離子的熒光探針成為近年來的研究熱點之一。雖然目前已有的鋁離子熒光化學傳感器無論是選擇性、靈敏性，還是檢測限、響應速度，普遍具有較好的理化特性,但是，該類化學傳感器往往需要復雜的合成過程，能夠通過簡單一步反應合成的報道較少。而且，大多數水溶性差，不易在水體系中進行熒光檢測，故難以開發細胞成像，不能實現相應熒光探針在細胞層次或者組織層次上進行鋁離子的生理、生化行為的研究[9-11]?；谏鲜霭l展狀況，我們將煙酰肼和羥基萘醛通過縮合反應合成一個席夫堿配體，并研究其在溶液及細胞內的鋁離子熒光檢測能力。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑 所用試劑均為分析純，實驗用水由Labconco WaterPro水系統制備，煙堿肼(阿拉丁試劑)，2-羥基-1-萘甲醛(安耐吉化學)，硝酸鋁(天津市化學試劑六廠)，甲醇(天津市化學試劑六廠)，復方氫氧化鋁片 (山西云鵬制藥有限公司)，MCF-7細胞（美國ATCC細胞庫）

1.2 儀器 RF-5301型熒光分光光度計，Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，Bruker AVANCE III 400 MHz核磁共振波譜儀，LCQ電噴霧質譜儀，尼康Nikon ECLIPSE Ti全自動倒置顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 探針化合物L的合成 參考相關文獻[12]，化學反應如圖1所示。稱取2-羥基-1-萘甲醛1.72 g(10 mmol)置于圓底燒瓶中，用20 mL無水乙醇溶解，稱取煙堿肼1.37 g(10 mmol)，用20 mL無水乙醇溶解，置于恒壓滴液漏斗中，緩慢滴入圓底燒瓶。設定油浴溫度為100℃，加熱攪拌回流5 h，反應過程中用TLC檢測。反應結束后，抽濾，濾餅再用甲醇重結晶1次，得黃色結晶2.13 g，產率73.12%。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ（ppm）12.60（s，1H，OH-Ar）,12.37（s，1H，-NH-），9.47 （s，1H，=CH），7.24～9.15（m，10H，HAr）.IR（KBr cm-1）：υC=O1 692.3，υ（Schiff-base）C=N1 597.1。

圖1 探針分子L的合成Fig 1 Synthesis of probe L

1.3.2 探針化合物L的熒光性質研究

1.3.2.1 靈敏性實驗：將5 μL 1.0×10-4mol/L探針化合物L加入到2 mL甲醇，Tris-HCl緩沖溶液為9∶1混合溶劑的樣品池中（終濃度為2.5×10-7mol/L），然后逐漸加入1.0×10-5mol/L硝酸鋁的甲醇溶液（每次5 μL），測試熒光光譜。

1.3.2.2 選擇性實驗：2.5×10-7mol/L探針L溶液，分別加入 K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+、Al3+溶液（K+、Ca2+、Na+、Hg2+的濃度是L濃度的50倍，Cd2+、Mn2+的濃度是L濃度的10 倍，Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的濃度是 L 濃度的5倍，Al3+的濃度是L濃度的1倍），待金屬與L充分反應后，測試熒光光譜。

1.3.2.3 Job’s-Plot方法確定L與A13+結合的配位比：保持配體L與Al3+的總濃度不變（終濃度為5×10-7mol/L），改變配體L與Al3+摩爾比測定其熒光強度值。

1.3.3 細胞成像實驗 乳腺癌細胞（MCF-7）培養借鑒于美國標準菌庫ATCCHB-8065，通過含體積分數10%胎牛血清（FBS）的完全培養基進行傳代培養。使用倒置熒光顯微鏡拍攝加入鋁離子前后的細胞熒光成像。

2 結果

2.1 探針L的熒光性能研究

2.1.1 靈敏性 在甲醇：Tris-HCl緩沖溶液為9：1的混合溶劑中，配體L與加入的不同濃度的硝酸鋁溶液充分反應后，在波長為409 nm的光激發下進行熒光光譜測試。從圖2可以看出，隨著Al3+的加入，L可產生顯著的熒光增強趨勢，并隨著鋁離子的濃度增大而增強，最大發射峰位于458 nm和480 nm處。此外，鋁離子濃度在0～0.3 μmol/L范圍內與熒光強度保持了良好的線性關系。以I/I0→1對[Al3+]作圖，根據IUPAC對于檢測限的定義，根據公式DL=K×Sb1/S（K取3，Sb1為空白溶液的標準偏差，S為校準曲線的斜率）計算，能得到配體檢測金屬離子的最低濃度，即配體L對金屬離子的檢測限為 2.3×10-9mol/L。

圖2 探針分子L在甲醇/Tris-HCl混合溶劑中的Al3+熒光滴定譜圖Fig 2 Fluorescence emission changes of L in methanol/Tris-HCl solution upon the addition of increasing amount of Al3+

2.1.2 選擇性 配體L與加入的不同金屬離子充分反應后，進行熒光性質考察。以波長409 nm光源為激發光，測得熒光強度變化情況如圖3所示?？梢钥闯?，配體探針L加入不同金屬離子的熒光強度變化不同，雖然其它各種金屬離子在溶液中濃度顯著高于配體探針 L（K+、Ca2+、Na+、Hg2+的濃度是 L濃度的50倍，Cd2+、Mn2+的濃度是L濃度的10倍，Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的濃度是 L 濃度的 5 倍，Al3+的濃度是L濃度的1倍），加入其它常見金屬離子充分反應后，配體L熒光強度沒有較大改變；加入Al3+時，配體L響應非常明顯，由此確定熒光探針L對鋁離子具有較好的選擇性。

圖3 探針分子L在甲醇/Tris-HCl混合溶劑中，加入不同金屬離子的熒光光譜(λex=409 nm)Fig 3 Fluorescence spectra of probe L in the presence of various metal ions in methanol/Tris-HCl solution(λex=409 nm)

2.2 L與A13+結合配位比的確定 了解金屬離子與有機配體間的配位比例，可以為確定配合物的結構及闡明熒光增強的機理提供重要信息。保持配體L與Al3+的總濃度不變（5×10-7mol/L），Al3+的濃度占總濃度的比例在0～1之間變化，通過繪制熒光強度與相應Al3+所占濃度比值的線性曲線，擬合得到L與Al3+絡合的配位比，得到如圖4所示的結果。由Job’s plot曲線可以看出，當[Al3+]/[Al3++L]的比值在0.33左右，即Al3+與L的配比為1：2時熒光強度達到最高點，因此可以推測出，鋁離子結合兩個配體形成配合物。為了進一步確定A13+與L的結合方式，采用ESI-MS譜對Al3+-L形成的復合物進行了表征。質譜中出現的強峰（m/z 607.2），其對應的結構為[Al（L）2]+（calcd m/z 607.2）。

2.3 細胞成像研究 給藥配體設置為10 μmol/L，溶液為PBS緩沖溶液，給藥1 h后顯微鏡下觀察拍照。拍照完成后，再往配體組加入15 μmol/L的Al（NO3）3，給藥1 h后觀察拍照。由圖5可以看出，在細胞中外加Al（NO3）3后，可以觀察到非常明顯的熒光現象，表明探針分子可進入細胞檢測過量的鋁離子。

圖4 探針分子L與Al3+的熒光Job's plot曲線(λex=409 nm)Fig 4 Job plot of probe L with Al3+based on fluorescence spectra

圖5 探針分子L在乳腺癌細胞（MCF-7）中的細胞成像圖Fig 5 Fluorescent imaging of probe L in MCF-7 cells

2.4 量化計算 用Gaussian 09程序包[13]，采用密度泛函理論（DFT），在 B3LYP 水平用 6-31+G（p，d）基組，對探針分子L和形成的2∶1配合物進行構型優化。優化的分子結構見圖6，可以看到萘環上羥基的氫原子和C=N雙鍵上氮原子的距離為1.828?，O-H…N角度為142.5°，形成分子內氫鍵，符合激發態分子內質子轉移（ESIPT）機制。L及其鋁配合物的前線分子軌道圖見圖7，最高占據軌道HOMO的能量分別為-5.899 eV和-7.719 eV，最低空軌道LUMO的能量分別為-2.372 eV和-5.398 eV，說明配合物具有更好的熱穩定性。L和配合物的HOMO電子云主要集中在羥基取代的萘環上，而LUMO的電子云分布在整個分子，符合分子內電荷轉移（ICT）機制。

圖6 探針分子L的優化構型圖Fig 6 Optimized structures of probe L

圖7 探針分子L與AlL2配合物的HOMO和LUMO軌道能級圖Fig 7 Views of HOMO and LUMO of probe L and AlL2

3 討論

本文合成了一種煙酰肼席夫堿熒光探針，其合成原料便宜，制備簡便，結構通過紅外譜圖和核磁譜圖得以確認。光譜研究顯示，探針L在甲醇-水緩沖溶液中對Al3+具有良好的選擇性，其檢測限可達到納摩爾級別，通過質譜和Job’s plot曲線可確定探針分子L與Al3+形成2∶1的穩定絡合物。該探針對Al3+的響應可以歸于ESIPT機制[14]和ICT機制[15]，并通過量化計算證明。探針分子羥基的氫原子和C=N雙鍵上氮原子形成分子內氫鍵，存在激發態分子內質子轉移(ESIPT)現象，加入鋁離子后，發生去質子化作用，抑制了探針分子的ESIPT進程，因而熒光增強。分子具有較大的極性和明顯的分子內電荷轉移(ICT)效應，與鋁離子結合后對熒光團的推-拉電子作用產生影響，從而導致熒光光譜的變化。由于探針分子在水體系下也可以發射出很強的熒光，因此可用于檢測藥物及生命體系的鋁離子含量。本實驗制備的新型探針L是一種靈敏度極高并具有很強選擇能力的Al3+熒光探針，有望應用于生物醫藥領域。