巰基化羧甲基殼聚糖載醋甲唑胺納米球滴眼劑的生物安全性評價

李光遠 ，婁建石 ，陳 斌 ，李 楠 ，王曉輝 ，劉佩莉 ，祝君梅

（1.天津醫科大學藥理學系，天津300070；2.天津市醫藥科學研究所醫用生物材料監測研究中心，天津300020）

醋甲唑胺（methazolamide，MTZ）是一種新型的碳酸酐酶抑制劑[1]，通過抑制睫狀體中的碳酸酐酶，使房水生成減少，降低眼內壓。其作為眼科治療開角型青光眼、繼發性青光眼的常用藥物，在臨床上得到廣泛應用[2-3]。本實驗采用乳化-蒸發-交聯法，以巰基化羧甲基殼聚糖（thiolatedcarboxymethyl chitosan,tCMCS）為載體[4-5]，包裹 MTZ 形成納米球（thiolatedcarboxymethyl chitosan-carried methazolamide nanoparticles，tCMCS-MTZ-Ns），將其制備成滴眼劑（thiolatedcarboxymethyl chitosan-carried methazolamide nanoparticles eye drop，tCMCS-MTZ-NED)[6]。對該滴眼劑進行眼刺激試驗、遲發超敏試驗、細胞毒性試驗（MTT法和LDH法），為該滴眼劑的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑醋甲唑胺原料藥（武漢大華偉業醫藥化工有限公司。批號：20160912，純度為99.2%），羧甲基殼聚糖（CMC，浙江澳興生物科技有限公司，分子量30萬，羧化度80%），三聚磷酸鈉（TPP，分析純，天津市光復科技發展有限公司)，甲醛（天津市化學試劑批發公司，分析純，150215），生理鹽水（中國大冢制藥有限公司，5K72G2），2,4-二硝基氯苯（天津光復精細化工研究所，化學純，批號：2015年7月11日），弗氏完全佐劑（Sigma，批號：SLBF9338V），二甲基亞砜（天津瑞金特化學品有限公司，批號：2014/05），四唑鹽（MTT，BIOSHARP），1640 培養液（HyClone，批號：NZL1265），胰酶細胞消化液（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，批號：312ML0110），乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（貨號：A020-2，微量酶標法），聚山梨酯-80（Tween-80，分析純，天津市光復科技發展有限公司），乙酸乙酯（分析純，天津市光復科技發展有限公司），乙醇（分析純，天津市光復科技發展有限公司），乙醚（分析純，天津市光復科技發展有限公司）。

細胞株：NCTCclone929（小鼠成纖維細胞L-929，來源：中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）。

1.1.2 實驗動物 日本大耳白兔，雄性，2.0～2.5 kg（北京隆安實驗動物養殖中心，許可證編號：SCXK（京）2014-0003）實驗前適應性飼養1周。白化豚鼠，雄性，300～400 g（北京隆安實驗動物養殖中心，許可證編號：SCXK（京）2014-0003），實驗前適應性飼養3d。

1.1.3 儀器 酶標儀（芬蘭雷勃公司，MK3），CO2培養箱（賽默飛世爾科技公司，HERAcell 150i），全溫振蕩培養箱（上海精宏實驗設備有限公司，HZP-150），LYL-Ⅱ裂隙燈顯微鏡（鳳凰光學儀器集團有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 tCMCS-MTZ-NED制備 將MTZ原料藥溶于乙酸乙酯，加入混合乳化劑(Tween-80和無水乙醇)，在常溫下超聲，滴入0.5%HCl，繼續超聲，滴入tCMC溶液，待乳液變清時，再滴入TPP溶液，繼續超聲，即得到載藥納米球混懸液。6 000 r/min離心20 min，所得沉淀用乙醚沖洗，-80℃低溫冰箱中保存，經冷凍干燥機制成凍干品。

1.2.2 浸提液制備

1.2.2.1 遲發超敏試驗浸提液制備：tCMCS-MTZNED按照0.2 g/mL的比例使用生理鹽水和芝麻油在37℃下浸提72 h。

1.2.2.2 細胞毒性試驗浸提液制備：tCMCS-MTZNED按照0.2 g/mL的比例使用含胎牛血清的DMEM培養液在37℃下浸提72 h。

1.2.3 遲發型超敏反應試驗 選用體質量300～400 g皮膚完好的健康白化豚鼠50只，將50只豚鼠按體重分層隨機分為5組，樣品生理鹽水浸提液組10只，芝麻油浸提液組10只，陰性對照生理鹽水和芝麻油浸提介質組各10只，陽性對照組0.5%2，4-二硝基氯苯10只。試驗前24h剪剃背部區域被毛。

皮內誘導：試驗時用75%酒精消毒試驗區域后在脊柱兩側從頭向尾成對的進行3對(6個點)皮內注射，每點注射0.1 mL。第一對A液，為弗氏完全佐劑與生理鹽水或芝麻油等體積混合。第二對B液，為試驗樣品浸提液，對照組為陰性或陽性對照液。第三對C液，為A液與B液等體積混合。

局部誘導：皮內注射后6 d，各注射部位用10%十二烷基硫酸鈉按摩導入，24 h后按組貼敷于B液中浸泡至飽和的濾紙片，固定并留置48 h。

激發：局部誘導后13 d，剪去豚鼠腹部毛發，用75%酒精消毒試驗區域后，按組貼敷于C液中浸泡至飽和的濾紙片，固定并留置24 h。

除去敷貼物后24 h和48 h，觀察貼敷區皮膚的紅斑、水腫等反應，按Magnusson和Kligman分級標準（表1）對每一激發部位和每一觀察時間皮膚紅斑和水腫反應進行描述并分級。記錄觀察時間和激發部位紅斑和水腫反應分級。

表1 Magnusson和Kligman分級Tab 1 Grading of Magnusson and Kligman

1.2.4 體外細胞毒性試驗

1.2.4.1 MTT法：在96孔培養板上接種L-929細胞，接種密度為1×104/mL的細胞懸液，每孔100 μL，細胞培養24 h后，棄去原培養液?？瞻捉M（BL）用細胞培養液交換，陰性對照組用浸提比例為0.2 g/mL高密度聚乙烯浸提液（PE）交換，陽性對照組用含5%二甲基亞砜（DMSO）的細胞培養液交換，試驗樣品組用載銀納米粒凝膠劑浸提液或納米銀浸提液進行交換。置CO2培養箱內37℃培養72 h。更換培養液后 72 h，每孔加入 20 μL、5 g/L 四唑鹽(MTT)溶液繼續培養4 h后棄去孔內液體，加入150 μL二甲基亞砜，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標儀570 nm和630 nm處測定各孔吸光度。計算相對增殖率（RGR）。細胞毒性反應分級見表2。

表2 細胞毒性反應分級Tab 2 Cytotoxic reaction grading

計算公式為RGR（%）=（570 nm材料組平均值-630 nm材料組平均值/570 nm陰性對照組平均值-630 nm陰性對照組平均值）×100%。

1.2.4.2 LDH法：在96孔培養板上接種L-929細胞,接種密度為1×104/mL的細胞懸液，每孔100 μL，細胞培養24 h后，棄去原培養液?？瞻捉M用細胞培養液交換，陰性對照組用浸提比例為0.2 g/mL高密度聚乙烯浸提液交換，陽性對照組用含1%Triton-X-100的細胞培養液交換，試驗樣品組用浸提液進行交換。置CO2培養箱內37℃培養72 h。更換培養液后72 h，每孔按照說明依次加入試劑盒中試劑，混勻，室溫靜置5 min，450 nm波長處酶標儀測定吸光度值。計算LDH總釋放率（T）。結果見表5。

計算公式為T（%）=（試驗樣品組的平均吸光度值-溶劑對照組的平均吸光度值）/（Triton-X-100對照組的平均吸光度值-溶劑對照組的平均吸光度值）

1.3 統計分析 采用SPSS17.0進行統計學分析，計算MTT試驗中tCMCS-MTZ-NED的半數生長抑制濃度(IC50)和LDH試驗中LDH釋放率達到50%時tCMCS-MTZ-NED的濃度。

2 結果

2.1 遲發型超敏反應試驗 見表3。試驗結果表明，受試組和陰性對照組在去除貼敷24 h和48 h后未見紅斑、水腫，陽性對照出現不同程度紅斑反應，實驗材料對豚鼠不致敏。

表3 tCMCS-MTZ-NED對豚鼠遲發型超敏反應試驗結果(n=10)Tab 3 Results of delayed type hypersensitivity of tCMCS-MTZNED in guinea pigs (n=10)

2.2 體外細胞毒性試驗

2.2.1 MTT試驗結果 見表4。試驗結果表明，試驗樣品的浸提液細胞毒性反應為2級。

2.2.2 LDH試驗結果 見表5。試驗結果表明，試驗樣品浸提比例為0.2 g/mL時，LDH釋放率為37.09%。

表4 tCMCS-MTZ-NED MTT試驗結果Tab 4 MTT test results for tCMCS-MTZ-NED

表5 tCMCS-MTZ-NED LDH試驗結果Tab 5 LDH test results for tCMCS-MTZ-NED

2.2.3 統計學分析 結果采用SPSS17.0進行統計學分析，計算得出MTT試驗中tCMCS-MTZ-NED的半數生長抑制濃度（IC50）為0.24 g/mL，LDH試驗中LDH釋放率達到50%時tCMCS-MTZ-NED的濃度為0.54 g/mL。

3 討論

醋甲唑胺是一種碳酸酐酶抑制劑，碳酸酐酶（CA）是一種含鋅金屬酶，它在睫狀上皮細胞中催化CO2和H2O最終生成CO32-，透過腔膜分泌于房水。由于溶液要保持電中性，Na+向房水分泌增加，同時帶動Cl-向房水遷移，從而在房水形成高滲透壓，促進H2O向房水方向運動，保持房水的離子平衡及其流量[7-8]，而青光眼患者由于房水回流不暢引起眼內壓升高。碳酸酐酶抑制劑可抑制CA的活性，使HCO3-的生成減少，從而減少 HCO3-、Na+、Cl-和 H2O進入房水，使房水生成減少，起到降低眼內壓作用，臨床上用于治療青光眼[9-10]。Calvo[11]等研究發現，納米球給藥系統使角膜滲透性提高了4～5倍。徐詠梅[12]等研究發現巰基化羧甲基殼聚糖生物黏附性更高。本實驗首次使用巰基化改性的羧甲基殼聚糖衍生物用于局部眼科給藥的載體材料，除改善親水性，還可與角膜外黏液層中的糖蛋白黏附，使納米球能更好地集聚在角膜表面，緩釋的MTZ不斷通過角膜屏障進入房水并維持有效濃度，達到提高MTZ生物利用度的目的。

在此之前，已對本實驗材料進行了眼刺激試驗，試驗結果表明動物雙眼對光反射良好，角膜區透明，虹膜、結膜正常，均未見充血，眼瞼無水腫，無分泌物生成[13]。本研究依據GB/T16886《醫療器械生物學評價》的評價方法[14]，對產品進行了遲發超敏試驗和體外細胞毒試驗，遲發超敏試驗結果表明本材料對豚鼠皮膚無致敏性，在體外細胞毒性試驗中，試驗樣品濃度為0.2 g/mL和0.1 g/mL的浸提液細胞毒性反應為2級，其原因可能是由于納米球可以透過細胞膜進入細胞內或進入細胞器，并和生物大分子發生反應，使生物膜發生結構改變，從而產生細胞毒性。本試驗通過兩種方法測定了給藥系統的細胞毒性。MTT試驗主要檢測細胞線粒體功能障礙，即琥珀酸脫氫酶活性的抑制，從而考察細胞活性和生長狀態;而LDH試驗是檢測受試物對細胞膜的破壞。試驗結果提示實驗材料引起細胞毒性的機理主要是通過影響細胞器的功能，但LDH試驗結果顯示實驗材料也引起了一定程度細胞膜的破壞，為毒性機制的分析提供依據。IC50是細胞半數致死時所需要的藥物濃度，該指標能夠定量地反映tCMCS-MTZ-NED濃度對細胞毒性的影響，為tCMCS-MTZ-NED的生物安全性評價提供更加全面的數據支持。