DNA提取方法優化及Taqman探針法檢測牛肉及其制品中的豬源性成分

□ 李建平 邵淑娟 賈南南 曾慶真 武 玲 山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院

肉及其制品是人體蛋白質的重要來源之一，隨著我國經濟水平的提升，肉及肉制品已經成為人們餐桌的主角。因豬肉與牛肉的價格差距較大，在利益的驅使下，各種以假亂真，以次充好的事件頻頻發生。目前檢測肉類摻偽的方法有物理方法、化學方法、ELISA方法、色譜法、PCR方法等[1-3]。隨著分子生物技術研究的深入，PCR及熒光定量PCR越來越多地應用于食品檢測領域[4-5]。本文旨在研究牛肉及其制品中DNA的提取純化方法及采用熒光定量PCR方法中的靈敏度較高的Taqman探針法檢測牛肉及其制品中的豬源性成分。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

生牛肉2份（超市）、熟牛肉2份（熟食店）、牛肉卷10份（火鍋店、自助餐廳）。

1.2 實驗儀器及試劑

高速離心機、核酸蛋白分析儀、熒光定量PCR儀；CTAB（生工）、EDTA（碧云天）、SDS（生工）、DNA提取試劑盒（天根）、2×TaqMan Fast qPCR Master Mix（ 生工）。

2 實驗方法

2.1 火鍋底料中DNA的提取方法研究

2.1.1 改良 CTAB法[6]

稱取100 mg粉碎均勻的樣品置于2 mL離心管中，加入1 000 μL 2%的CTAB裂解液，4 μL的RNaseA酶（僅新鮮組織樣品加入），輕柔振蕩15 s，靜置5 min。然后再加入10μL的蛋白酶K，輕柔振蕩15 s，置于60 ℃水浴30 min，期間顛倒混勻2-3次；12 000 r/min離心5 min，取上清液700μL，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），輕緩顛倒15 s后室溫靜置1 min；12 000 r/min室溫下離心10 min；轉移上清液于一新的1.5 mL離心管中，加入0.8倍體積預冷的異丙醇，顛倒混勻后于-20 ℃靜置1～2 h沉淀DNA；12 000 r/min室溫離心10 min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀兩次。晾干，使用50 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，待測或于-20 ℃保存備用。

2.1.2 改良SDS法[7-8]

在2 mL離心管中加入100 mg樣品，加入1 mL 20% SDS混勻，65 ℃水浴30 min，期間顛倒數次；加入200 μL 3 mol/L NaAC溶液混勻，4 ℃ 15 000 r/min離心10 min；取上清液加等體積氯仿-異戊醇（24∶1）混勻，12 000 r/min室溫離心2 min，加入0.8體積預冷的異丙醇，沉淀DNA；12 000r/min室溫離心5 min，棄上清液；用70%乙醇洗沉淀兩次，晾干，使用50μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，待測或于-20℃保存備用。

2.1.3 試劑盒法參照說明書。

2.2 實時熒光PCR方法檢測

2.2.1 實時熒光PCR方法[9-10]

根據標準SN/T3730.8-2013中設計以豬線粒體atp8基因組系列設計的引物與探針，分別提取不同來源的牛肉及其制品中的總DNA作為模板，在熒光定量PCR儀上對目標序列進行擴增。反應體系為：2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 10 μL，DNF Buffer 2μL，10 μM Forward Primer 0.4 μL， 10 μM Reverse Primer 0.4 μL， 10 μM probe 0.4 μL，Template DNA 1μL (10-250 ng/μL)。反應條件為：94 ℃，3 min，（94 ℃，5 s；60 ℃，30 s）40 cycles。內參采集信號為YELLOW，目標模板采集信號為GREEN。

2.2.2 檢測方法靈敏度與熒光定量標準曲線

將提取自豬肉組織的DNA分別進行10倍等梯度稀釋，采用熒光定量PCR方法中的靈敏度較高的Taqman探針法進行檢測，以Ct值為35時對應的模板DNA的濃度作為該方法的檢出限。同時根據各濃度梯度的擴增曲線，建立Ct值-模板DNA濃度的標準曲線，可應用于牛肉及其制品中豬源性成分的定量檢測。

2.2.3 特異性實驗

分別用牛肉、羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉、馬肉等動物樣品的DNA進行特異性實驗。

3 結果與分析

3.1 樣品DNA 提取及純化方法比較[11]

在DNA提取純化過程中，一般遵循兩個原則：一是防止和抑制DNA酶對DNA的降解；二是盡量減少對溶液中的DNA的機械剪切破壞。本研究設計的改良SDS法和改良CTAB法也是基于這兩個原則。CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。十二烷基磺酸鈉（SDS）是強效表面活性劑，可以將細胞膜裂解。DNA處理結果見表1。試劑盒法對生鮮組織及加工食品的提取的DNA的純度最好，就提取DNA的濃度來說，SDS法及CTAB法提取的DNA的濃度均較高，在300-1000 ng/μL，試劑盒法提取的DNA的濃度在70-110 ng/μL?？偟膩碚f，SDS法所用試劑價格便宜，花費較小，且提取的DNA濃度較高，適合實驗室使用；而試劑盒法操作簡單迅速，提取DNA的純度較高，濃度對下一步進行檢測適用，不用經過進一步的稀釋。

表1 不同方法提取DNA結果比較

圖1 引物探針特異性分析圖

圖2a 熒光定量PCR對數曲線圖

圖2 熒光定量標準曲線統計圖

3.2 引物與探針特異性

用本實驗的引物與探針在相同的熒光反應條件下對豬肉、牛肉、羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉、馬肉等動物樣品的DNA進行特異性實驗，除豬肉出現典型的對數曲線外，其他肉均未出現典型的對數曲線（如圖1所示）。

3.3 檢測方法靈敏度與熒光定量標準曲線

從圖2中可以看出，標準曲線方程 為 Ct= -3.617×log(conc) + 24.860，r2=0.989 82，表明該方法在DNA模板稀釋濃度范圍內線性良好。鑒于國內外熒光定量PCR檢測技術標準均將Ct值為35時的DNA的質量濃度作為方法的檢測限，根據本研究的標準曲線，Ct值為35時的熒光體系中DNA的質量濃度為 8.165×10-5ng/μL。

4 討論

自國外假牛肉事件曝光以來，我國也加強了對牛肉及其制品的監管，并且每年均針對市場需求對牛肉及其制品進行抽檢，監測牛肉的摻偽現象。本研究建立了牛肉及其制品中DNA的提取純化方法及采用熒光定量PCR方法中的靈敏度較高的Taqman探針法檢測牛肉及其制品中的豬源性成分，該方法特異性較好，檢測靈敏度高，并且通過建立的標準曲線可以有效地判定樣品是摻偽還是污染。運用本方法對市售的牛肉及其制品進行檢測，檢測出部分樣品存在摻偽現象，少量樣品存在污染情況。所以本方法可以為監管機關在牛肉及其制品的質量控制提供有力的技術手段。