納米二氧化鈦暴露對青春期小鼠乳腺的影響

季坤源，高 慧，董巧香*

(溫州醫科大學a檢驗醫學院 生命科學學院，b公共衛生與管理學院，浙江 溫州 325035)

納米顆粒，又稱超細粒子，其粒徑介于1～100 nm之間，具有宏觀材料不具有的許多優異特性，如表面效應、小尺寸效應和量子隧穿效應等[1-2]。隨著科技的發展，納米材料逐漸走入人們生活。納米二氧化鈦是應用最廣泛的納米材料之一，廣泛應用于化妝品、紡織品、遮光劑、消毒劑以及運動用品等。研究發現，在暴露納米二氧化鈦的小鼠肝臟、肺、腦可以檢測到納米顆粒的存在。

隨著納米材料應用的普及，近年來它的安全性也受到普遍關注[3]。納米二氧化鈦可通過呼吸道達到肺泡末端，誘發肺的氧化應激、炎癥反應，長期會造成肺的纖維化[4]，同時納米二氧化鈦可進入血液[5-6]，影響大腦功能[7]，造成肝臟損傷[8]等。研究發現，與柴油機尾氣中的顆粒物和炭黑等納米粒子相比，納米二氧化鈦對睪丸間質細胞有更強的毒性。納米二氧化鈦可透過雄性小鼠血睪屏障，導致雄性小鼠的體重增長率、精子質量與活性遠低于對照組[9]。青春期雄性小鼠暴露于不同濃度的納米二氧化鈦，成年后采集血清與睪丸進行相關指標檢測發現，納米二氧化鈦的濃度越高，小鼠血清睪酮的含量越低，睪丸組織學改變程度越大[10]。Gao等[11]研究發現，納米二氧化鈦可顯著降低雌性小鼠血清雌激素的含量，小鼠卵巢功能下降。納米二氧化鈦可能通過影響性激素水平或性激素信號通路，從而影響睪丸和卵巢[10-11]。

本研究采用C57BL/6-GFP品系的雌性小鼠為模型，研究納米二氧化鈦暴露對青春期小鼠乳腺發育影響。通過對乳腺的異常變化分析納米二氧化鈦在乳腺病變發展過程中的作用，為探究納米二氧化鈦作為環境污染物的作用機制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6-GFP小鼠引種于南京醫科大學，現本實驗室可自行繁殖。小鼠飼養過程嚴格按照溫州醫科大學動物管理中心實驗動物規則飼養?；\具、飲用水及飼料中均不含納米二氧化鈦，可以排除外界環境因素對實驗的干擾。

1.1.2 儀器與試劑

動物麻醉系統，美國Microflex公司；石蠟切片機，德國Leica公司；光學顯微鏡及解剖顯微鏡，日本尼康公司。

納米二氧化鈦粉末(5 nm)，碧云天公司；蘇木精、伊紅，美國Sigma公司；Ki67抗體，美國Thermo公司；ERα抗體，美國Santa公司；酒精、福爾馬林、二甲苯溶液和封片劑，美國Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

將3周齡雌性小鼠隨機分為3組，每組5只，分別為對照組(超純水)、納米二氧化鈦低劑量處理組(50 mg·kg-1)和納米二氧化鈦高劑量處理組(250 mg·kg-1)，在相同的時間點每天灌胃1次，持續28 d。第29 d小鼠麻醉后頸椎脫臼處死，并記錄體重。取出小鼠的肝臟和子宮，稱重并拍照。取出小鼠乳腺，腹股溝處乳腺用于組織整體染色(WM染色)，胸腺處乳腺固定于福爾馬林溶液中，采用常規石蠟包埋。

1.2.2 乳腺組織學定量分析

乳腺導管進行病理學切片和HE染色，觀察到導管的4種形態，即正常的雙層細胞結構為主的乳腺導管、多個細胞層增生性病變的導管、非典型腺管增生的導管和發生原位癌的導管。顯微鏡下對以上乳腺導管形態分別進行觀察計數，計算增生性導管結構所占比例。

1.2.3 免疫組織化學染色

將組織切片脫蠟，浸到梯度酒精中進行水合，然后放到提前預熱的抗原修復液中，15 min后放入封閉內源性過氧化物酶中，取出進行細胞透膜，然后敷血清和一抗，過夜后去掉一抗，敷二抗并染DAB，觀察到棕色后進行蘇木精復染， 然后酒精脫水，最后封片保存。顯微鏡下觀察Ki67和ERα的表達情況，當1個導管染上棕色的細胞數占總細胞數比例大于或等于20%時，認為該導管表達此抗原。計算Ki67和ERα表達導管所占比例。

1.2.4 統計分析

采用Graphpad Prism 6軟件對數據進行單因素方差分析及t檢驗，測定結果以平均值±標準差表示，P<0.05時判定為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 對青春期小鼠肝臟、子宮的影響

肝臟作為外來藥物代謝的重要器官，它的變化反映藥物毒性的大小。圖1所示，處理組肝臟指數沒有顯著變化，表明該劑量納米二氧化鈦對小鼠未產生顯著的毒性效應。子宮作為哺乳動物重要的生殖器官，對乳腺的發育具有重要的調節作用。實驗結果顯示，處理組小鼠子宮長度和寬度均未發生明顯的變化，說明納米二氧化鈦對小鼠子宮形態無顯著影響。

圖1 小鼠的肝臟指數與子宮的長寬度

2.2 對青春期小鼠乳腺導管形態的影響

小鼠乳腺導管密度和末端芽數量見圖2。如圖所示，低劑量處理組小鼠乳腺末端芽數量較對照組顯著增加，高劑量處理組乳腺導管密度較對照組降低。

圖2 小鼠乳腺形態學結構

2.3 對青春期小鼠乳腺病理學結構的影響

正常的乳腺導管結構由2層細胞構成，這種結構有利于小鼠懷孕時導管分化為腺泡，便于乳汁的分泌與輸送。當乳腺發生病變時，出現多層細胞的增生，懷孕時導管分化為腺泡和腺泡分泌乳汁的能力降低。如圖3所示，低劑量納米二氧化鈦處理以后，增生性導管的比例有增加的趨勢，高劑量暴露對增生性導管的比例沒有明顯的影響。

圖3 小鼠乳腺組織病理學結構

2.4 對青春期小鼠乳腺導管Ki67和ERα表達的影響

對乳腺導管分別進行Ki67和ERα染色，以研究納米二氧化鈦對乳腺的作用機制。Ki67是增殖蛋白，處在有絲分裂期的細胞高表達Ki67，主要定位在細胞核中。ERα為雌激素受體，主要表達在乳腺的管腔干細胞中，在細胞膜、細胞質、細胞核中都有表達。雌激素與細胞核上的雌激素受體結合可引發基因調控機制，進一步控制下游基因的轉錄。如圖4所示，低劑量納米二氧化鈦暴露顯著增加青春期小鼠乳腺導管Ki67和ERα的表達。

圖4 小鼠乳腺導管Ki67和ERα的表達

3 討論

本研究對C57BL/6-GFP轉基因雌性小鼠在青春期時進行納米二氧化鈦暴露，研究發現，處理組小鼠肝臟指數、子宮長度和寬度均較對照組無顯著差異。低劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺末端芽的數量顯著增加，Ki67和ERα的表達量顯著上升。高劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導管密度降低。

已有納米二氧化鈦的安全性研究結果不一致，納米二氧化鈦的應用是否安全還沒有明確的結論。納米二氧化鈦可通過呼吸道、消化道、皮膚以及注射等多種途徑進入機體，損傷體內組織器官[12]。納米二氧化鈦具有小粒徑效應，可通過簡單的自由擴散和滲透方式進入體內，透過細胞膜進入細胞乃至核內，另外納米二氧化鈦具有高化學活性，這一特性促使細胞損傷，從而影響細胞的增殖、分化及凋亡[13-14]。

青春期乳腺導管密度、分支結構、末端芽的數量和病理學結構的異常變化是乳腺病變發展過程中的重要參考因素[15-16]。本研究結果顯示，高劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導管變得稀疏，可能是高劑量的納米二氧化鈦抑制了小鼠乳腺的發育，低劑量沒有這一作用。青春期小鼠末端芽有促進導管分支、延長的作用[17]，研究發現，小鼠經低劑量納米二氧化鈦處理后，末端芽顯著增加，說明低劑量納米二氧化鈦促進了乳腺的異常發育，但高劑量納米二氧化鈦的暴露對小鼠乳腺末端芽沒有明顯的影響。為了探究納米二氧化鈦的作用機制，對乳腺導管進行了Ki67和ERα染色。青春期小鼠低劑量納米二氧化鈦暴露能夠使乳腺Ki67表達量顯著增加，Ki67是反映細胞增殖能力的蛋白標志物，可能是納米二氧化鈦損傷乳腺細胞，機體為了平衡乳腺代謝，使處于靜止期的乳腺干細胞進行快速增殖。在乳腺癌患者中，雌激素受體表達量與激素治療是否敏感有關[18-19]，經低劑量納米二氧化鈦處理后小鼠乳腺導管高表達ERα蛋白。ERα是雌激素信號通路的下游蛋白，推測低劑量納米二氧化鈦可能通過干擾性激素信號通路影響乳腺的發育。高劑量納米二氧化鈦處理對小鼠乳腺導管Ki67和ERα的表達沒有顯著的影響，可能因為暴露劑量過高導致機體反應遲鈍。本研究結果為進一步探究納米二氧化鈦對小鼠乳腺的毒性作用和潛在機制提供新的依據和啟示。