孕期納米銀暴露對子代小鼠乳腺的影響

孫曉偉，高 慧，董巧香*

(溫州醫科大學 a檢驗醫學院 生命科學學院，b公共衛生與管理學院，浙江 溫州 325035)

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由其作為基本單元構成的材料[1]，與普通材料相比，它在光學、熱學、電學、磁學、力學以及化學等方面具有獨特的性質[2]。納米銀(silver nanoparticles，AgNPs)是1種粒徑小于100 nm的銀單質，由于其具有良好的抗菌作用，現已成為應用最廣泛的納米產品之一[3-4]。已有研究發現，納米銀具有一定細胞毒性[5]、肝臟毒性[6]、生殖毒性[7]等生物毒性效應。Ivask等[8]在體外實驗時發現，不同粒徑的納米銀可以穿過哺乳動物細胞的細胞膜，對細胞產生損傷，粒徑越小，毒性越強。體內實驗表明，納米銀可以通過Balb/c小鼠的胎盤屏障或通過母乳而傳遞給子代，并引起胚胎的發育異常[9]。

乳腺干細胞(mammary stem cells，MaSCs)是一類成體干細胞，它對于雌性哺乳動物乳腺的發育十分重要[10]。乳腺上皮細胞分為基底細胞群和管腔細胞群[11]，乳腺干細胞可以分為基底干細胞和管腔干細胞，而乳腺干細胞的異常有可能會誘導形成乳腺癌干細胞，并進一步導致機體發生癌變。

本研究以FVB-GFP小鼠為實驗動物，對孕期小鼠進行納米銀暴露，研究納米銀對子代小鼠乳腺導管和乳腺干細胞的影響，從而揭示納米銀誘導乳腺癌發生的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

成年FVB-GFP小鼠購自美國Jackson實驗室，小鼠飼料和飲用水經過嚴格檢測，均不含納米銀，可以排除外界因素對本實驗的干擾。

1.1.2 實驗儀器

石蠟切片機購自Leica公司；光學顯微鏡購自尼康公司；流式細胞儀購自BD公司；二氧化碳培養箱購自Thermo公司。

1.1.3 試劑耗材

納米銀、蘇木精、伊紅購自Sigma公司；Epicult-B基礎培養基、Epicult-B Proliferation Supplement、Mammocult基礎培養基和Mammocult Proliferation supplement購自Stem Cell公司；氯化銨溶液、0.25% Trypsin-EDTA、DNase I、Dispase和抗鼠CD24-PE抗體購自Stem Cell公司；抗人/鼠CD49f-PE/Cy7抗體購自Biolegend公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

將3月齡FVB-GFP雌性小鼠平均分成2組，根據雌雄比2∶1進行合籠，看到陰道栓的當天記作懷孕第0 d，懷孕第12～18 d進行灌胃處理。將納米銀顆粒放到超純水中，超聲，制成混懸液。處理組每日灌胃50 mg·kg-1納米銀混懸液，對照組灌胃同樣記錄的超純水[12]。

1.2.2 小鼠臟器及乳腺組織的采集與處理

小鼠麻醉后，頸椎脫臼處死。將小鼠腹部向上固定，用外用手術刀剪開外皮，取下左側胸腺處乳腺，放到福爾馬林中，用于石蠟包埋以及病理切片的制備。左側腹股溝處乳腺在玻片上攤平后放到固定液中用于整體染色，右側乳腺消化后制成單細胞懸液。用內用手術刀剪開腹腔膜，取出子宮和肝臟，稱重后，放到福爾馬林溶液中固定。

1.2.3 細胞流式分選

將組織放到消化液中，恒溫培養消化，依次加入氯化銨、胰蛋白酶、中性蛋白酶和DnaseⅠ，得到單細胞懸液。分別加入不同熒光素標記的CD24-PE、Streptavidin-APC、CD49f-PE/Cy7抗體，分選得到不同的細胞群：Lin-CD24+CD49fhi基底干細胞和Lin-CD24hiCD49flo管腔干細胞。

1.2.4 微球和3D培養

將分選得到的不同細胞群按照一定比例種在不含血清的培養基中，5 d后形成微球，計數并計算微球形成率。在顯微鏡下挑取約50個微球重懸于基底膜基質中，加入含有血清的培養基，9 d后，觀察并記錄3D結構的形態和大小。

1.2.5 乳腺增生導管的定量分析

將浸泡在福爾馬林中的乳腺組織用石蠟包埋后，4 μm切片，然后經過伊紅-蘇木素染色，可以清晰看到乳腺導管的結構。正常的乳腺導管由2層細胞構成，而增生導管細胞層數發生明顯紊亂。在顯微鏡下統計正常和增生導管的數目，計算增生導管的比例。

1.3 數據統計分析

采用Graphpad Prism 6軟件對數據進行單因素方差分析及T檢驗, 測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 對子代小鼠肝臟和子宮的影響

孕期納米銀暴露對子代小鼠肝臟和子宮的影響見圖1。肝臟指數可以在一定程度上反應藥物的毒性強弱。研究發現，處理組小鼠肝臟指數顯著降低，表明納米銀對小鼠產生了顯著的肝臟毒性效應。子宮是雌性哺乳動物重要的生殖器官，它對于乳腺的發育具有非常關鍵的調節作用。取出小鼠子宮，測量其長度和直徑，小鼠子宮的長度和直徑并無顯著差異，表明孕期納米銀暴露對子代小鼠的子宮并沒有產生毒性效應。

圖1 小鼠肝臟指數和子宮形態變化

2.2 對子代小鼠乳腺形態的影響

為了觀察納米銀對乳腺形態的影響，用胭脂紅染液對乳腺組織進行整體染色并觀察(圖2)。正常的乳腺導管具有清晰的二級和三級分支結構，處理后三級結構明顯減少。同時，乳腺組織中的淋巴結可以表征炎癥反應，由圖可以看出處理后淋巴結面積明顯增大，表明孕期納米銀暴露可以引起子代小鼠的炎癥反應。

圖2 小鼠乳腺導管形態

2.3 對子代小鼠乳腺病理學結構的影響

乳腺組織包埋后4 μm切片，經過伊紅-蘇木素染色后，可以清晰看到乳腺導管的細胞組成(圖3)。正常導管由規則的2層細胞組成，增生后，細胞層數增多。處理后增生導管的比例并沒有發生明顯的變化。

上述結果表明孕期納米銀暴露子代乳腺導管并沒有產生明顯的病變。

圖3 小鼠乳腺病理學結構

2.4 對子代小鼠乳腺干細胞組成的影響

根據不同的細胞表面標記，乳腺干細胞可以分為2個不同的細胞群：基底干細胞群(Lin-CD24+CD49fhi，MRU)和管腔干細胞群(Lin-CD24hiCD49flo，CFC)。處理后，基底干細胞和管腔干細胞占總乳腺上皮細胞的比例并沒有發生明顯變化，表明孕期納米銀暴露并不會改變子代小鼠乳腺干細胞的組成(圖4)。

圖4 小鼠乳腺干細胞組成變化

2.5 對子代小鼠微球和3D形態的影響

將分選得到的細胞群進行無血清培養后可以得到乳腺微球結構，統計每1 000個細胞形成的微球個數(圖5)。研究發現，處理后管腔干細胞的微球形成率顯著降低，但是基底干細胞的微球形成率沒有發生變化。將管腔干細胞形成的微球重懸于基底膜基質中，可以形成3D結構。測量3D結構的直徑，并統計空心結構的比例，發現處理組3D結構的直徑明顯降低，而且空心結構的比例也顯著減少。孕期納米銀暴露可以降低管腔干細胞的微球形成率，并且影響其3D結構的直徑和形態。

3 討論

納米銀因其具有廣泛的殺菌作用而應用到日常生活的方方面面。研究發現，納米銀可以通過口服、皮膚接觸、靜脈注射等多種方式進入生物體內，并隨著血液循環運輸到身體的其他部位[13]。通過嚙齒類動物的體內和體外實驗發現，納米銀可以產生各種生物毒性效應，并傳遞給子代[14]。

本研究以FVB-GFP轉基因小鼠為實驗動物，在懷孕第12～18 d進行連續一周的納米銀暴露。處理后子代小鼠的肝臟指數發生了顯著的變化，說明納米銀可以產生一定的毒性，但是這種毒性效應并沒有影響子宮的形態發育。

有研究發現，乳腺導管的分支結構、密度以及病理學結構的異常等都有可能成為乳腺組織發生病變的參考因素[15]。本實驗中，處理后的乳腺導管二級和三級結構發生了明顯的異常變化，這說明，孕期納米銀暴露可能是子代乳腺病變甚至發生癌變的一個危險因素。同時，淋巴結面積的增大說明機體產生了炎癥反應，表明納米銀可能通過炎癥反應使乳腺形態發生異常。

在乳腺干細胞的微球和3D形成實驗中，發現納米銀可以影響管腔干細胞的微球形成率，但是對基底干細胞幾乎沒有影響。通過進一步的3D重懸培養，發現納米銀可以顯著減小3D結構的直徑，而且其形態也發生了明顯的變化。

圖5 小鼠乳腺微球和3D結構形態

孕期是納米銀暴露的一個敏感窗口。納米銀可以產生肝臟毒性，影響乳腺導管的形態，對乳腺干細胞尤其是管腔干細胞的發育與分化具有顯著的影響，這些發現為乳腺病變或乳腺癌的預防與治療提供了一定的理論參考價值，其機制還有待于我們的進一步探索。