小鼠腘窩淋巴結模型評價3種中藥注射液的潛在免疫毒性

林 琳，范瀟予，李恩燦，凌亞豪，臧清策，林 生，賀玖明，靳洪濤，3，*

（1．中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所新藥安全評價研究中心，北京 100050；2．中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050；3．北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司，北京 100176）

近幾十年來，臨床上關于中藥注射液(traditional Chinese medicine injections，TCMIs)不良反應報道日益增加[1]，其中，發生率最高的是免疫介導的藥物不良反應，如急性過敏反應、過敏性休克[2]。 既往研究[3]發現，5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF)及其二聚體[5，5’-oxydimethylenebis(2-furfural)，OMBF]可能與含糖中藥注射液引發的免疫刺激(如超敏反應和自身免疫反應)有一定的相關性。已有研究[4-6]表明生脈、脈絡寧和丹香冠心3種注射劑在臨床中均能夠引起包括過敏反應在內的不良反應。我們在前期市售中藥注射液5-HMF及其二聚體的篩查中發現生脈、脈絡寧和丹香冠心注射劑均含有較高含量的5-HMF及OMBF[7-8]。因此，探究此3種注射液潛在的免疫毒性以及5-HMF單體和二聚體可能發揮的作用十分必要。由于5-HMF及其二聚體均為小分子化合物，傳統致敏試驗動物模型可能存在假陰性結果，因此本研究選擇小鼠直接腘窩淋巴結(direct popliteal lymph node assay，D-PLNA)和報告抗原腘窩淋巴結(reporter antigen popliteal lymph node assay，RA-PLNA)模型對上述3種注射液進行了免疫毒性評價，進而初步探究免疫毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級BALB/c小鼠，6～8周齡，體質量18～22 g，共128只，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養環境保持室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，保持12 h晝夜節律，動物自由進食水，試驗過程中動物使用和相關處置符合動物福利倫理要求。

1.2 供試品與試劑

丹香冠心注射液(批號51150106)、脈絡寧注射液(批號20140928)、生脈注射液(批號13120711)，均由中國醫學科學院藥物研究所分析代謝中心賀玖明老師提供。陽性對照藥物苯妥英鈉(批號57-41-0)，購自美國Sigma-Aldrich公司。報告抗原TNP-Ficoll(批號044807)和TNP-OVA(批號047104)，規格均為每瓶10 mg，均購自美國BioSearch公司。小鼠IgE預包被ELISA試劑盒(批號E2820-1607-1)和小鼠MCP-1預包被ELISA試劑盒(批號E2739-1601-1)，均購自達科為生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組設計 小鼠按體質量隨機分為16組，其中D-PLNA模型為5組，即生理鹽水對照組，脈絡寧、生脈、丹香冠心注射液各1組，陽性藥物苯妥英鈉對照組；RA-PLNA模型為11組，即上述5組分別聯合報告抗原三硝基苯基聚蔗糖(2，4，6-trinitrophenyl-Ficoll，TNP-Ficoll)和三硝基苯基卵蛋白(TNP-ovalbumin，TNP-OVA)作用組，另設生理鹽水對照組，每組8只。報告抗原的劑量為每只10 μg，給藥體積均為50 μL，陽性藥物給藥劑量為每只2 mg。上述3種中藥注射液中5-HMF和OMBF的給藥濃度和劑量見表1。1.3.2 給藥及樣本收集 D-PLNA模型中，BALB/c小鼠后足趾部70%酒精消毒，用1 mL注射器針頭于左側足趾部皮下注射3種中藥注射液及陰、陽性受試物，右側為對照側。給藥后第7天，取出淋巴結，備用。RA-PLNA模型中，將3種中藥注射液、陽性藥物和生理鹽水分別與10g TNP-OVA或TNP-Ficoll粉末混合后，注射于小鼠足趾部，給藥方式相同，取出淋巴結后備用。將各組淋巴結置于200目不銹鋼篩網上，用玻璃研磨器輕輕研碎，同時以1% FBS-1640沖洗淋巴細胞液于培養皿中，吹勻并收集細胞懸液，4 ℃ 、1 5 00 r/min離心后，重懸并進行細胞計數。按下面公式計算細胞指數(cellularity index，CI)。

表1 3種中藥注射液中5-HMF和OMBF給藥濃度及劑量

CI=處理側淋巴結細胞數/未處理側淋巴結細胞數

1.3.3 ELISA法測定免疫相關因子濃度 將淋巴結細胞懸液培養于96孔板，加入刺激劑脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，濃度為4 μg/mL，均為每孔100 μL，培養箱孵育16～18 h，收集細胞上清液。參照ELISA試劑盒說明書分別測定上清液中免疫球蛋白IgE、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)的濃度。

1.4 統計及分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。結果均以-x±s 表示，進行單因素方差分析，組間差異比較采用LSD法。此外，CI≥2且與陰性對照組比較有顯著差異，認為模型的細胞指數反應呈陽性。

2 結果

2.1 細胞濃度

在D-PLNA模型中(表2)，注射液丹香冠心和苯妥英鈉陽性對照組的處理側與對照側以及生理鹽水對照組比較，淋巴結細胞濃度均顯著升高，CI 也顯著升高(P＜0.05)，但丹香冠心組CI小于2，提示丹香冠心組DPLNA反應為陰性。加入報告抗原TNP-OVA后，與對照側相比，各中藥注射液組細胞濃度有上升的趨勢，但均無統計學意義(P＞0.05)；加入報告抗原TNPFicoll后，與對照側相比，脈絡寧、生脈、丹香冠心注射液以及陽性對照組細胞濃度均顯著升高(P＜0.05)，脈絡寧、丹香冠心注射液較生理鹽水對照組亦顯著升高(P＜0.05)，且各組CI 均大于2(表3)，提示RA-PLNA反應為陽性。

表2 D-PLNA模型中3種中藥注射液對淋巴結細胞濃度的影響(-x±s，n=8)

2.2 相關免疫因子的濃度變化

2.2.1 中藥注射液對IgE的影響 免疫球蛋白IgE是介導I型超敏反應的重要細胞因子。在D-PLNA模型中，3種中藥注射液對IgE無促進作用(表4)。與對照側相比，加入TNP-OVA后，脈絡寧、丹香冠心注射液與陽性藥物對照組IgE水平顯著升高(P＜0.05)，加入TNPFicoll后，脈絡寧注射液和陽性藥物對照組均促進IgE的分泌，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表5。

表3 RA-PLNA模型中3種中藥注射液對淋巴結細胞濃度的影響(-x±s，n=8)

表4 D-PLNA模型中，3種中藥注射液對IgE和MCP-1濃度的影響(-x±s，n=8)

表5 RA-PLNA模型中，3種中藥注射液對IgE和MCP-1濃度的影響(-x±s，n=8)

2.2.2 中藥注射液對MCP-1的影響 結果顯示，在D-PLNA模型中，與對照側相比，各組均無顯著差異(表4)。加入報告抗原后，丹香冠心注射液與報告抗原TNP-OVA共同作用時，與生理鹽水陰性對照組相比顯著促進MCP-1的分泌(P＜0.05)，而與TNP-Ficoll聯合給藥后，與未處理側相比，MCP-1濃度顯著升高(P＜0.05)；而脈絡寧與生脈注射液與TNP-Ficoll作用時，和生理鹽水組相比，MCP-1濃度均顯著升高(P＜0.05)，見表5。

3 討論

在直接腘窩淋巴結實驗(D-PLNA)中，只有丹香冠心注射液細胞濃度顯著增加。由于中藥注射液成分復雜，5-HMF單體和二聚體為小分子化合物，需要與蛋白結合后才能誘發免疫失調，所以我們需要利用RAPLNA模型進一步觀察其對淋巴細胞的影響，對中藥注射液的致敏性進行更完整深入的評價，以充分提示臨床用藥風險[9]。

在報告抗原腘窩淋巴結實驗(RA-PLNA)中，本實驗選取TNP-OVA和TNP-Ficoll兩種報告抗原。TNPOVA是一種T細胞依賴性抗原，當給予極低劑量時，自身不會誘發免疫反應，需要輔助性共刺激信號存在時才能誘導免疫應答產生抗體。而TNP-Ficoll是一種非T細胞依賴性抗原，只有存在新的抗原表位并被T細胞識別后，才能產生IgE抗體，并誘導免疫應答[10-11]。MCP-1是促炎細胞因子，由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和角化細胞分泌，可以激活巨噬細胞，刺激嗜堿性粒細胞釋放組胺[12]。實驗結果顯示，脈絡寧注射液加入0.2 μg/μL TNP-OVA后，IgE分泌顯著增加，而加入0.2 μg/μL TNP-Ficoll后，細胞濃度及MCP-1濃度與對照側相比顯著升高，提示脈絡寧注射液中可能存在小分子物質，可以作為一種新的抗原與報告抗原結合后被T細胞識別誘導免疫反應。生脈注射液僅與0.2 μg/μL TNP-Ficoll共同作用時，細胞計數指標呈陽性，且MCP-1濃度較對照側顯著升高，提示我們生脈注射液中也可能存在作為新的抗原分子的物質。丹香冠心注射液與0.2 μg/μL TNP-OVA共同作用時，顯著促進IgE和MCP-1的分泌，而加入相同劑量TNP-Ficoll后，細胞濃度和MCP-1濃度與對照側相比顯著升高，同時在D-PLNA中，細胞數顯著增加，提示丹香冠心注射液成分復雜，可能直接誘導Ⅰ型超敏反應，也可能作為半抗原的小分子物質與報告抗原結合誘發超敏反應。

總之，在D-PLNA模型中反應為陰性的指標，在注射劑與報告抗原共同作用后，出現了陽性結果，由于D-PLNA容易出現假陰性，對于半抗原引起的免疫失調不敏感的特點，我們可以得出結論，RA-PLNA對于5-HMF單體和二聚體的致敏性更為敏感，而通過加入不同的報告抗原能夠進一步確證受試物在體內僅僅是炎癥刺激物還是形成了新的抗原或表位[13]，為進一步的機制研究提供思路和方向。但由于中藥注射液成分復雜，可能同時存在包括5-HMF單體以及二聚體等多種小分子物質，對其單獨成分的進一步免疫評價也十分必要。

與此同時，中國藥典對中藥注射液中5-HMF及其二聚體的含量限度并沒有明確的規定，我們先前的研究證明5-HMF可以作為一種輔助刺激因子誘導Ⅰ型免疫反應，OMBF可提供輔助刺激信號和作為新的抗原表位被識別，從而誘導Ⅰ型和Ⅱ型混合型免疫反應，也能促進非同源的T、B細胞間相互作用[3]。本實驗結果進一步證明了5-HMF及其二聚體OMBF可能在中藥注射液中作為小分子半抗原與體內蛋白相結合造成免疫系統的失調。因此，為了進一步提高用藥安全，對相關中藥注射液中小分子物質5-HMF單體及二聚體的質量控制和深入研究非常必要。