丁草胺對金魚主要器官酯酶和過氧化物酶同工酶的影響

張曉紅，高晉華，范軒坤，陳婉珊，李瑞梅

（太原師范學院生物系，山西 太 原 030031）

丁草胺又稱去草胺、馬歇特、滅草特，可抑制和破壞禾本科雜草幼根蛋白質的合成而除草，應用廣泛，現已成為中國三大除草劑之一[1]，2015年丁草胺使用量約占除草劑用量的50%～60%[2]。除草劑隨雨水沖刷最終釋放到水環境，美國明尼蘇達州地表水中發現乙草胺殘留濃度為1.2～2.5 μg/L[3]，菲律賓湖泊和河流中丁草胺殘留濃度達1.9～5.1 ng/L、地表水中達0.163 ng/L，而中國稻田水中達0.56～1.07 mg/L[4]，在一些工業區的土壤中含量超過國家標準數倍[5]。環境中殘留的丁草胺會對水生生物造成危害。組織病理學研究發現丁草胺對魚類有較高毒性，使魚鰓、肝胰臟和腎臟細胞水腫甚至中度壞死[6]， 染色體發生畸變[7]，影響斑馬魚胚胎發育、生殖能力及性激素和甲狀腺激素的產生[8-9]等。

酯酶(esterase，EST)同工酶在酯代謝和生物膜的結構等方面發揮作用，能催化酯鍵水解，屬于水解酶類[10]，具有解毒作用，可水解大量外源酯類化合物。過氧化物酶(peroxidase，POD)同工酶能利用H2O2氧化供氫體，反映生物體產生和消除自由基的能力[11]及體內代謝狀況，對逆境反應敏感，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。研究表明除草劑百草枯、2，4-D丁酯、丁草胺均對金魚血清酯酶、過氧化物酶同工酶具有一定影響[12-13]，而對金魚組織器官同工酶影響的研究還未見報道。因此，本文通過檢測市售60%丁草胺乳油對金魚(Carassius auratus)主要器官EST、POD同工酶的影響，探討丁草胺的環境風險，為丁草胺對人類健康影響的研究提供基礎依據，為農田、水域丁草胺使用量、殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象和受試物

金魚體質量(4.5±0.5) g，體長(5.5±0.5) cm，購于太原市花鳥魚蟲市場。丁草胺乳油(有效成分含量60%)購自太原市順登農業科技發展公司。丁草胺，CAS23184-66-9，分子式C17H26ClN O2，熔點＜-5 ℃，沸點156 ℃，相對密度1.06～1.07(25 ℃)，分解溫度165℃，閃點100 ℃。原藥純品為100 μg/mL淡黃色油狀液體，能溶于丙酮、乙醇、甲醇、苯等多種有機溶劑，在水中溶解度為2 mg/L?？构庑粤己?，275 ℃開始熱分解，pH值4以下不穩定。商業劑型為60%乳油或5%顆粒劑。

1.2 急性染毒

丁草胺(60%乳液)對金魚染毒24 h的半數致死濃度(lethal concentration 50，LC)為1.31 mL/L[12]，據此配制

50 0.4、0.8、1.2 mL/L濃度組，設0.9%生理鹽水為對照組，每組選取金魚5尾，按0.1 mL/g的劑量腹腔注射，24 h后進行檢測，試驗期間不投餌。實驗重復3次。

1.3 酶活性測定

染毒24 h后，立即將金魚取出，紗布擦干，斷尾，血止后，冰上取心臟、肝胰臟、鰓、腎臟，并立即置于含有生理鹽水的平底試管中(每條魚的相同組織取量相當)，冰上搗碎，高速冷凍勻漿機勻漿，取上清，分裝于離心管中，1 500 r/min冷凍(4 ℃)離心20 min，取上清，按2∶1的比例(V/V)加入40%甘油和0.1%溴酚藍指示劑。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測酶活性。POD同工酶用聯苯胺染色，EST同工酶參照Shaw和Prasad[13]的方法染色，拍照。

1.4 統計分析

采用Gel-Pro analyzer凝膠圖像分析軟件計算酶帶積分光密度(integrated optical density，IOD)值，分析遷移率(migration rate，Rf)。Rf=樣品移動的距離/溴酚藍移動的距離。以SPSS 18.0軟件，采用One-Way ANOVA進行方差分析，Duncan Multiple Range test進行校正。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 丁草胺對金魚心臟、肝胰臟、鰓、腎臟EST同工酶的影響

對照組與丁草胺0.4 mL/L組金魚心臟EST同工酶不表達(圖1A、表1)，濃度為0.8 mL/L時出現Rf 0.200(遷移率為0.200)的新條帶，活性IOD值為7.0(圖1C)；濃度為1.2 mL/L時活性增加了3倍，達20.8，且各濃度組間差異顯著(P＜0.05)，同時增加Rf 0.275和Rf 0.487的2條新條帶，活性分別為13.8和22.4，與對照組相比差異顯著(P＜0.01)， 0.8 mL/L與 1.2 mL/L濃 度 組 間 差 異 顯 著(P＜0.05)。

金魚肝胰臟EST同工酶在對照組有Rf 0.237、0.325和0.563共3條條帶，活性均較強，IOD值分別為76.5、 60.2、 96.7(圖 1B、 1D)。 隨 丁 草 胺 濃 度 增 加(0.4、 0.8、 1.2 mL/L)， 3條 條 帶 活 性 分 別 由 46.5、29.2、69.9減弱到9.8、8.9、31.1，兩者呈負相關(相關系數r值和P值分別為r=-0.992，P=0.008；r=-0.955，P=0.045；r=-0.984，P=0.016)，各濃度組與對照組相比差異均具有統計學意義(P＜0.01)，各濃度組間條帶差異亦有統計學意義(P＜0.05)。

對照組金魚鰓EST同工酶有Rf 0.429條帶，活性微弱，IOD值為12.0(圖1C、1G)，丁草胺0.4 mL/L時活性升高為20.2，顯著高于對照組(P＜0.01)，0.8 mL/L時活性消失，1.2 mL/L時活性恢復至對照水平，各濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

對照組金魚腎臟EST同工酶有Rf 0.438條帶，極微弱表達，IOD值為10.7(圖1D、1H)，丁草胺0.4 mL/L時活性升高為27.9，顯著高于對照組(P＜0.01)；0.8和1.2 mL/L時活性消失，且與0.4 mL/L間差異顯著(P＜0.05)。

表1 丁草胺染毒后金魚EST同工酶的IOD(-x±s，n=3)

2.2 丁草胺對金魚心臟、肝胰臟、鰓、腎臟POD同工酶的影響

對照組和丁草胺0.4 mL/L、0.8 mL/L時，金魚心臟POD同工酶不表達(圖2A，表2)。1.2 mL/L時出現Rf 0.113新條帶，IOD值為50.3，活性顯著高于對照組(P＜0.01)，與0.4和0.8 mL/L濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

對照組金魚肝胰臟POD同工酶Rf 0.100條帶IOD值為53.2(圖2B、2D)，隨丁草胺濃度增加，活性先升高后降低(72.0、83.9、25.2)，0.8和1.2 mL/L濃度組與對照組相比差異顯著(P＜0.01)。各濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

圖2 丁草胺對金魚POD同工酶活性的影響

表2 丁草胺染毒后金魚POD同工酶的IOD(-x±s，n=3)

對照組金魚鰓POD同工酶Rf 0.185條帶IOD值為39.9(圖2C、2G)，丁草胺0.4 mL/L時活性升高為55.5，0.8 mL/L時消失，1.2 mL/L時活性急劇升高為65.3，與對照組差異顯著(P＜0.05)，0.8 mL/L與其他濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

對照組金魚腎臟POD同工酶Rf 0.343活性較強(IOD值73.9)(圖2D、2H)，丁草胺0.4和0.8 mL/L時活性消失，1.2 mL/L時IOD值為57.6，顯著低于對照組(P＜0.01)。1.2 mL/L與其他濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

丁草胺低濃度(0.4 mL/L)時，供應心腦的血液中外源丁草胺，經肝胰臟、血清[12]、鰓、腎臟EST同工酶的應急解毒后已極微量，因而心臟EST同工酶與對照組均無表達，丁草胺中濃度(0.8 mL/L)時金魚心臟EST同工酶出現1條新條帶，活性是對照組的7倍，而在接近半數致死濃度(1.2 mL/L)時EST同工酶表型復雜，活性極強，達到對照組的50多倍，說明心臟在丁草胺中、高濃度時發生應激反應，這與Xiang等[14]丁草胺對斑馬魚丙二醛(MDA)的毒性結果類似。低濃度(0.4 mL/L)時鰓、腎臟EST同工酶活性分別升高2倍、3倍，說明低濃度時丁草胺誘導鰓、腎臟EST同工酶活性，增強其解毒功能；肝胰臟EST同工酶具3條極強活性條帶，說明肝胰臟EST同工酶在酯類代謝中發揮著重要作用，隨丁草胺濃度增加肝胰臟EST同工酶活性逐漸降低，說明丁草胺對金魚肝胰臟EST同工酶活性具有極強的抑制作用。丁草胺中濃度(0.8 mL/L)時血清、鰓、腎臟EST同工酶活性降低或消失，可能是丁草胺抑制其合成或破壞其結構。高濃度(1.2 mL/L)時血液、鰓、腎臟及心臟EST同工酶活性急劇增強，可能是EST同工酶失去保護血細胞、鰓、腎臟及心臟細胞膜結構功能，細胞膜通透性改變，而使胞內被誘導的EST同工酶迅急大量釋放，以增強應急解毒功能，研究表明單?；视王ッ?MAGL)作為水解酶，在腫瘤細胞中高表達，促進腫瘤的發生、轉移、侵襲、存活以及在體內生長[15]，丁草胺對酯酶家族成員的作用還有待進一步研究。

丁草胺高濃度(1.2 mL/L)時金魚心臟POD同工酶出現1條新條帶，酶活性是對照組的50倍，說明高濃度時金魚心臟POD同工酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)抗氧化防御極強[16]，對丁草胺反應靈敏，結果與EST同工酶類似。

對照組腎臟POD同工酶活性極強，說明其在腎臟解毒過程中發揮重要作用。丁草胺低濃度(0.4 mL/L)時腎臟POD同工酶即消失，說明丁草胺對腎臟POD同工酶抑制作用最強，鰓、肝胰臟POD同工酶活性增強，說明鰓、肝胰臟對丁草胺的抗氧化能力強于腎臟、心臟。鰓、腎臟、肝胰臟POD同工酶活性變化與EST同工酶類似。

隨丁草胺濃度增加鰓POD同工酶活性升高、消失后又增強，腎臟POD同工酶活性消失后活性較對照組下降、肝胰臟POD同工酶活性升高后降低，結果與丁草胺使斑馬魚活性氧(ROS)下降[14]，肝胰臟SOD、谷胱甘肽S轉移酶(GST)酶活性下降[16]一致，反映POD同工酶高度的組織特異性，不同物種不同抗氧化酶對外源丁草胺抗氧化存在差異。POD同工酶中的過氧化物酶1具有抗氧化作用[17]，且在肝癌形成和惡性進展中發揮一定作用[18]，參與肝癌發生進展調控，在肝癌轉化細胞中表達升高，與凋亡抑制，腫瘤存活率增加有關，丁草胺與癌細胞的發生是否存在一定關系，仍需深入研究。

綜上所述，丁草胺對金魚不同組織器官EST、POD同工酶影響不同。丁草胺抑制金魚肝胰臟EST、腎臟POD同工酶活性，中濃度(0.8 mL/L)及以上丁草胺破壞鰓、腎臟EST、POD同工酶活性。60%乳油型丁草胺主要由丁草胺原藥和其他成分混制而成。酶活性的變化，是丁草胺的單獨作用還是復雜成分之間的協同作用仍有待進一步研究。