協同刺激分子B7-H4在小鼠食管癌前病變中的表達

陳欣然，單保恩*

（1．河北醫科大學第四醫院藥學部，河北 石 家莊 050011；2．河北醫科大學第四醫院科研中心，河北 石 家莊 050011）

食管癌是常見的消化道腫瘤，其全世界發病率和病死率分別居癌癥的第8位和第6位[1]。根據組織類型的不同，食管癌分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squmous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌[2]。中國食管癌發病率居世界第一，其死亡人數占全球該病死亡人數的50%以上，平均死亡率為15.02/10萬[3]。另外，中國食管癌發病率具有明顯的區域高發性，河北和河南太行山兩側區域是主要的高發區，且95%以上為ESCC[4]。ESCC的特點是早期無明顯癥狀，因此癌癥早期確診比例不足5%，絕大多數患者確診時已是中晚期。手術和放化療是ESCC的主要治療手段，但由于ESCC中晚期腫瘤細胞發生轉移，治療效果和預后較差，5年生存率不足20%[5]。

食管癌前病變是正常食管組織向ESCC轉變過程中的一種組織病理異常。根據病變程度的不同，癌前病變可分為低級別上皮內瘤變(low grade intraepithelial neoplasia，LGIN)和高級別上皮內瘤變(high grade intraepithelial neoplasia，HGIN)[6]。食管癌前病變包括了ESCC形成的整個過程，但尚未發生轉移。因此如果在食管癌前病變階段給予恰當的診斷和治療，治療效果顯著提高。

亞硝胺是一類作用廣泛的致癌物，其前體物硝酸鹽、亞硝酸鹽和二級胺廣泛分布于自然環境中。流行病學研究顯示，亞硝酸及硝酸鹽的高攝入是ESCC的重要病因。世界范圍內食管癌高發區飲水中硝酸鹽含量顯著高于低發區[7]。我國ESCC高發區，特別是涉縣、赤城縣的飲水中，硝酸鹽、亞硝酸鹽和二級胺的含量顯著高于其他地區，且與當地居民ESCC和食管癌前病變的患病率呈正相關[8]。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)是一種水溶性喹啉衍生物，化合物中含有硝酸氮，是一種誘癌的亞硝胺前體物[9]。小鼠食管癌前病變的病變進程和病理特征與人無明顯差異[10]，本研究中，我們利用4NQO飲水法誘導了小鼠ESCC癌前病變模型。我們發現，此模型很好地模擬了人ESCC形成過程，可以通過該模型研究ESCC形成的分子機制。

B7-H4，又稱B7s1或B7x[11]，是B7家族中成員，于2003年被3個實驗室同時發現。B7-H4蛋白在正常組織中表達呈陰性，但在許多惡性腫瘤組織中高表達，如肺癌[12]、 卵巢癌[13]、 前列腺癌[14]、 黑色素瘤[15]、胃癌和乳腺癌[16]，且與腫瘤的惡性程度和不良預后呈正相關。B7-H4在細胞膜、細胞質、細胞核和血清中均有分布[17]。細胞膜B7-H4主要在腫瘤的免疫逃逸中發揮作用，細胞質和細胞核B7-H4則主要參與調控腫瘤細胞增殖和細胞周期進程。然而，目前還未見關于B7-H4在食管癌前病變進程中的報道。

鱗狀細胞癌相關抗原(squamous cell carcinoma associated antigen，SCCA)是從宮頸鱗癌組織中分離的一組腫瘤相關性糖蛋白。研究發現SCCA-2在食管癌組織有選擇性表達，外周血SCCA表達與ESCC的腫瘤分期和病變長度呈正相關，其含量變化反映了ESCC病變的進展情況，可以作為食管腫瘤的輔助診斷和判斷疾病發展的一個重要依據[18]。本文通過研究B7-H4在食管癌前病變的小鼠食管組織的表達特點，比較在食管癌前病變進程中B7-H4和SCCA-2的表達差異，分析其臨床意義，探討其作為食管癌前病變生物標志的可能性，為ESCC的早期診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和實驗試劑

4NQO，購于美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒，購于上海捷瑞生物科技公司；兔抗人B7-H4單抗，購于美國GeneTex公司；兔抗人β-actin單抗，購于美國Rockland公司；羊抗兔熒光二抗，辣根過氧化物酶羊抗兔二抗，購于美國Sant Cruz公司；Western blot信號增強試劑盒，購于美國Thermo公司；SCCA-2 ELISA試劑盒，購于上海Blue Gene生物科技公司。C57BL/6小鼠，5～6周齡，雌雄各半，購于北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：114007000035608。動物飼養于SPF環境，溫度18～24 ℃，濕度40%～60%，照明按12 h/12 h明暗交替。所有動物實驗操作均符合河北醫科大學動物福利指導原則標準。臨用前將4NQO粉末溶于滅菌的蒸餾水中并稀釋至50 μg/mL。

1.2 模型建立

133只C57BL/6小鼠，適應性飼養1周后，分為空白對照組(n=42)和4NQO誘癌組(n=91)。實驗持續28周?？瞻讓φ战M28周內均給予無菌蒸餾水；4NQO誘癌組在第1～15周給予50 μg/mL的4NQO，第16～28周給予無菌蒸餾水。從第16～28周，每兩周處死一批動物，包括6只空白對照組和13只4NQO誘癌組小鼠。誘癌及實驗操作流程參見圖1。

1.3 標本收集

將小鼠摘眼球取血，室溫放置10 min，4 000 r/min離心10 min，分離血清。脫頸椎處死動物，暴露胸腔和腹腔，分離食管組織，用生理鹽水清洗殘余血液后，縱向剖開，然后從賁門端向舌端卷成多層圓筒形，并用大頭針固定。將固定好的食管組織放入4%多聚甲醛中固定72 h，石蠟包埋，之后切成4 μm連續切片，用于HE染色評價。

圖1 4NQO誘導小鼠食管癌前病變模型圖

1.4 HE染色

取組織標本，經95%乙醇溶液和二甲苯脫水透明后，石蠟包埋。自動切片機切成3 μm厚的切片，經二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后進行HE染色，中性樹膠封固，在光學顯微鏡下觀察食管組織的病理變化，中性樹膠封固。

1.5 免疫組織化學染色分析B7-H4的表達

將切片置于60 ℃恒溫箱干烤過夜，經過乙醇梯度脫水，二甲苯透明和3%的過氧化氫滅活內源性過氧化物酶20 min，高壓熱修復后，PBS清洗切片，滴加兔抗人B7-H4單克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜。PBS清洗后滴加牛血清白蛋白封閉液，37 ℃封閉45 min。PBS清洗后，滴加辣根過氧化物酶羊抗兔二抗，37 ℃孵育60 min。PBS清洗，DAB顯色劑顯色，中性樹膠封固。

免疫組織化學檢測結果由兩位病理科醫師獨立雙盲評估。光學顯微鏡下每張切片隨機觀察5個高倍(×400)視野，每個視野計數100個上皮細胞。在細胞質和(或)細胞膜上有棕黃色顆粒的視為陽性表達細胞。B7-H4表達水平評分標準：①陽性細胞比例得分，陽性細胞≤33%為1分，＞33%～66%為2分，＞66%為3分；②染色強度得分，無著色或淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。結果判斷：兩者相乘為最終得分，其中得分≤3分判定為B7-H4低表達組，得分＞3分判定為B7-H4高表達組[19]。

1.6 Western blot法檢測血清B7-H4蛋白表達

取血清，用BCA試劑盒進行蛋白定量，然后用生理鹽水將血清樣本稀釋至4 μg/μL。稀釋后的血清與上樣緩沖液按3∶1比例混合，100 ℃煮沸5 min變性。每個樣本取50 μL(150 μg)進行Western blot實驗至轉膜結束[20]。然后按Western blot信號增強劑試劑盒說明書進行操作：將膜用超純水洗2次，每次5 min。將膜浸入25 mL信號增強劑，搖床振蕩15 min。再將膜用超純水洗2次，每次5 min。脫脂奶粉封閉60 min后，將膜浸入用抗體稀釋劑稀釋的小鼠抗B7-H4單抗(1∶500)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次，熒光掃描分析。

1.7 ELISA法測定SCCA-2濃度

根據BCA定量的血清蛋白濃度，用生理鹽水將血清稀釋至5 μg/μL。用純化的抗體包被微孔板，然后加入50 μL標準品或血清樣本，然后依次加入生物素化的抗體、辣根過氧化物酶和標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。用酶標儀在450 nm下測定吸光度，并計算樣本血清SCCA-2濃度。

1.8 Western blot法檢測食管組織B7-H4蛋白表達

取食管組織，低溫勻漿，RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r/min低溫離心10 min后，轉移上清液至預冷的新離心管中，用BCA試劑盒進行蛋白定量[23]。在蛋白樣本中加入上樣緩沖液，置于沸水中煮沸5 min。取適量蛋白進行10% SDS-PAGE分離蛋白，并轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫條件下封閉60 min，再分別放入β-actin(1∶5 000稀釋)和B7-H4(1∶1 000稀釋)的單克隆抗體中，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入羊抗兔熒光二抗，37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次，熒光掃描分析。

1.9 統計學方法

數據分析均采用Graphpad prism 5.0數據分析系統。定量數據以平均值±標準差表示。用Spearman correlation analysis比較不同參數間的相關性，用Oneway ANOVA，Kruskal-Wallis analysis比較不同指標在兩組或多組間的差異。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 誘癌過程中食管組織的病理改變

從誘癌16周至28周，每2周解剖食管組織(圖2)。所有空白對照組小鼠食管組織表面光滑，食管大小粗細均正常。然而，4NQO誘癌組小鼠食管組織卻表現為不同程度的病理改變。從第16周至28周，食管上皮組織依次出現大小不同的白斑、增厚、凸起及大小不等的腫塊，且與人食管癌前病變組織相似。

HE染色結果顯示(圖3)，在整個誘癌過程中，食管組織經歷了從正常食管、LGIN至HGIN的病理改變過程。正常食管上皮細胞表現為細胞形態規則，細胞核和細胞漿大小正常。LGIN則表現為食管上皮增厚，黏膜層下1/2細胞失去極性，細胞核增大，核深染。HGIN則表現為上皮層進一步增厚，黏膜層超過1/2至全部細胞失去極性，細胞核逐漸增至最大值，核深染。LGIN和HGIN統稱為食管癌前病變，經過癌前病變的過程，食管鱗狀細胞癌形成。從HE染色結果分析，小鼠食管癌前病變的病理特征與人食管癌前病變特征非常相似[10]。

4NQO誘癌時間與食管病理變化之間的關系如表1所示，在本研究中，我們發現空白對照組小鼠食管組織未出現任何異常病理改變，而4NQO誘癌組小鼠食管組織病理級別隨著誘癌時間的延長逐漸提高，差異有統計學意義(r=0.55，P＜0.01)。另外，雌性與雄性小鼠食管組織病理改變無顯著差異(P＞0.05)。

綜上所述，4NQO飲水法可成功誘導小鼠食管癌前病變的形成。隨著誘癌時間的延長，病變級別逐漸提高。

圖2 誘癌過程中食管組織變化

圖3 誘癌過程中食管組織HE染色(×400)

2.2 免疫組化分析食管組織B7-H4表達及與病理級別的相關性

結果如圖4和表2所示，B7-H4蛋白表達于食管上皮細胞的胞漿和胞膜。根據評分結果(低表達或高表達)，22例正常食管組織只有2例B7-H4高表達(9.1%)；對于食管癌前病變組織，27例LGIN食管組織有11例B7-H4高表達(40.7%)，21例HGIN食管組織有17例B7-H4高表達(81.0%)。Spearman相關性分析表明(如表2所示)，B7-H4表達與病理級別呈正相關(r=0.57，P＜0.01)，而與小鼠性別無相關性(r=-0.03，P=0.79)。

表1 小鼠食管癌前病變進程中食管組織病理改變

表2 小鼠食管癌前病變進程中食管上皮組織B7-H4表達與組織病理級別的相關性

圖4 免疫組化檢測食管上皮組織B7-H4表達

2.3 B7-H4和SCCA-2蛋白在小鼠血清的表達

ELISA結果如圖5所示，正常、LGIN、HGIN 小鼠血清SCCA-2濃度分別為(1.97±0.70)、(1.94±0.57)、(2.73±1.17) ng/mL。食管癌前病變小鼠血清中SCCA-2濃度逐漸提高，與正常小鼠相比，HGIN小鼠SCCA-2濃度顯著高于正常對照組(P＜0.01)。

圖5 食管癌前病變進程中小鼠血清SCCA-2蛋白表達

通過Western blot方法檢測血清中B7-H4表達，結果如圖6所示。首先進樣不同量的血清蛋白(0、50、100、200 μg)，掃描其熒光值，考察實驗方法的靈敏度和線性。結果顯示，本方法在進樣量0～200 μg，線性良好，r2=0.998，可以滿足實驗要求。然后，根據HE檢測結果，選取不同食管病理級別的小鼠血清樣本進行檢測。結果表明，正常、LGIN、HGIN小鼠血清B7-H4相對表達濃度分別為0.31±0.62、0.46±0.61、0.87±0.90。與正常小鼠相比，HGIN小鼠血清B7-H4濃度顯著提高(P＜0.05)。

上述結果表明，與正常小鼠相比，B7-H4和SCCA-2蛋白在HGIN小鼠血清中表達均顯著提高。上述結果提示，B7-H4與SCCA-2兩種蛋白均可能成為ESCC及癌前病變的一種新的血清標志物，這對于ESCC的早期診斷具有重要意義。

2.4 Western blot蛋白在小鼠食管組織的表達

結果如圖7所示，誘癌第16～28周，對照組小鼠食管組織B7-H4表達無顯著改變。因此，將對照組所有小鼠食管組織B7-H4蛋白表達的數據整合。與對照組比較，隨著誘癌時間的延長，4NQO誘癌組小鼠食管組織B7-H4蛋白表達逐漸提高，特別是第26周和28周，B7-H4蛋白表達水平顯著提高，差異具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

綜上所述，小鼠4NQO誘癌模型中，隨著誘癌時間的延長，食管組織依次出現LGIN和HGIN的癌前病變特征，B7-H4表達也逐漸上調。B7-H4在小鼠血清的表達與食管組織的病理級別呈顯著正相關。上述結果提示，B7-H4可能參與了食管癌前病變的進程，促進了ESCC的形成，但其作用機制還有待進一步研究。

圖6 B7-H4在血清的表達

圖7 B7-H4在食管組織的表達

3 討論

目前，腫瘤動物模型主要包括自發性動物模型，轉基因動物模型，誘發性動物模型和移植性動物模型。食管癌前病變模型無自發性和轉基因模型的報道，目前主要適用誘發性病變模型。在小鼠誘發性食管癌及癌前病變模型中，常用的誘癌劑主要有4NQO、甲基芐基亞硝胺和對甲基戊基亞硝胺。甲基芐基亞硝胺和對甲基戊基亞硝胺只能用于大鼠實驗而不能成功誘導小鼠ESCC及癌前病變，應用受到一定限制[21]。

雖然Tang和Tsang曾報道4NQO可誘導小鼠ESCC形成[22]，但對于食管癌前病變尚無詳細報道。本研究利用4NQO飲水法成功誘導了食管癌前病變，并詳細評價了食管癌前病變進程中的病理變化，以及癌前病變的主要特點。在誘癌過程中，我們發現對照組小鼠食管組織未出現病理變化，而誘癌組第16周食管上皮組織出現白斑，停用誘癌劑后，食管組織病變級別進一步提高。HE染色結果顯示，在整個誘癌過程中，食管組織經歷了從正常食管組織、LGIN至HGIN的病理改變過程。比較小鼠LGIN和HGIN病理特征，與人食管癌前病變特征基本一致[10]。統計分析表明，4NQO誘癌組小鼠食管組織癌前病變級別與誘癌時間呈顯著正相關，也就是說，隨著誘癌時間的延長，食管組織病變級別逐漸提高。

ELISA和Western blot結果表明，與正常對照組相比，HGIN小鼠血清B7-H4和SCCA-2表達都顯著提高，這提示B7-H4與SCCA-2兩種蛋白，可能成為ESCC早期診斷的生物標志物。然而，由于兩種蛋白的檢測方法不同，不能對兩種蛋白的表達進行詳細比較。Western blot方法因為靈敏度較低，不是檢測血清蛋白的最佳方法。然而，由于沒有檢測小鼠B7-H4的ELISA試劑盒，也沒有用于進行ELISA方法檢測的小鼠B7-H4單克隆抗體，本研究只能用Western blot方法替代。在以后的研究中，我們希望能夠有機會利用ELISA的方法更精確的檢測B7-H4在食管癌前病變小鼠血清的表達變化，為食管癌前病變的血清學診斷提供更準確的依據。

利用Western blot方法檢測B7-H4在食管組織的表達，結果表明，正常對照組B7-H4表達較低，且整個誘癌過程中表達無明顯變化。與對照組相比，4NQO誘癌組小鼠B7-H4的表達逐漸提高，誘癌第26和第28周，B7-H4的表達水平顯著提高，差異具有統計學意義。這個結果與免疫組化的結果相互印證，且B7-H4 的表達與食管組織病理級別和誘癌時間呈顯著正相關。這些結果提示，B7-H4蛋白的表達可能參與或促進了食管癌前病變的形成，但其發揮的具體作用及作用機制還不清楚，仍需進一步研究。

在以后的研究中，為了更進一步明確B7-H4在小鼠食管癌前病變中所起的作用，可以通過轉基因小鼠進行誘癌實驗。具體地說，就是通過比較4NQO飲水法誘導B7-H4敲除和B7-H4野生型小鼠食管癌前病變形成的差異，以及在這個過程中相關分子表達變化，進一步明確B7-H4參與食管癌前病變形成的作用及分子機制，從而探討B7-H4在食管癌前病變診斷和治療中的意義。

總之，本研究利用4NQO飲水法成功建立了小鼠食管癌前病變模型，詳細研究了食管癌前病變進程的病變特征。在食管癌前病變進程中，B7-H4在食管組織和血清中表達均逐漸提高，提示其可能參與或促進了ESCC的形成，這為ESCC的早期診斷和治療提供新思路，但作用機制還有待進一步研究。