腦膠質瘤組織中lncRNA-LINC01116的表達變化及其意義

林樹楷，李鋼，周奮，劉仲海，隋建美

(1海南省第三人民醫院，海南三亞 572000；2貴州醫科大學附屬醫院)

腦膠質瘤起源于腦部神經膠質細胞，其發病率與病死率均居中樞神經系統惡性腫瘤之首[1]。腦膠質瘤的組織學亞型眾多，一般可分為毛細胞星形細胞瘤、彌漫型星型細胞瘤、間變型少突星型細胞瘤、少突膠質細胞瘤、間變型少突膠質細胞瘤、膠質母細胞瘤，而WHO則依據其惡性程度將其劃分為Ⅰ～Ⅳ級[2]。近年來，雖然外科手術、放療、化療、輔助治療等治療手段不斷拓展[3]，但腦膠質瘤患者的預后仍不容樂觀[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組非蛋白質編碼RNA的統稱，目前發現的lncRNA長度為20～200個核苷酸[5]。lncRNA作為一大類轉錄調節因子，能夠通過轉錄干擾與染色質重塑等途徑調控基因表達[6]，其中lncRNA-LINC01116已被證實在多種類型腫瘤中過表達。研究[7]發現，若用siRNA抑制前列腺癌中lncRNA-LINC01116的表達，則腫瘤細胞的增殖與疾病的進展都會受到抑制。但目前lncRNA-LINC01116在腦膠質瘤等惡性腫瘤中所起的作用尚未得到深入研究，因而也限制了其在臨床上應用的拓展。本研究采用實時熒光定量PCR法(qRT-PCR法)檢測腦膠質瘤組織中lncRNA-LINC01116，并分析其與腦膠質瘤臨床病理特征及患者預后的關系，以求判斷將其作為腦膠質瘤臨床病理診斷手段和評估患者預后指標的可能性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2005年3月～2010年9月海南省第三人民醫院收治的腦膠質瘤患者95例，男56例，女39例；年齡21～68歲，其中≤45歲51例、>45歲44例；無腦積水91例，有腦積水4例；病理類型為星形細胞瘤46例，膠質細胞瘤49例；腫瘤直徑<4 cm 34例，≥4 cm 61例；術前KPS評分≤70分23例，>70分63例；侵犯腦葉數<2個71例，≥2個24例；病理分級Ⅰ～Ⅱ級38例，Ⅲ～Ⅳ級57例。納入標準：①患者臨床資料完整，出院隨訪未失訪；②經病理科確診為腦膠質瘤；③為原發性腦膠質瘤；④未合并其他惡性腫瘤；⑤術前未經放、化療等其他抗腫瘤手段治療；⑥未合并嚴重代謝性疾??；⑦術后存活期超過3個月，以排除手術原因造成的死亡。手術留取腦膠質瘤組織95例份，另選同期經顱內減壓術切取的正常腦組織21例份作為對照。本研究經本院倫理協會批準，且患者及家屬均知情同意。

1.2 組織中lncRNA-LINC01116檢測方法 采用qRT-PCR法。將待測樣本置于勻漿器中磨碎，加入TRIzol?試劑，充分裂解后加入氯仿，冰浴5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清，加入異丙醇沉淀后，75%乙醇洗滌沉淀，收集RNA沉淀，加入適量DEPC水重分溶解。利用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測提取的總RNA濃度，取OD260/OD280值在1.8～2.0的樣本。利用TaKaRa RR047A PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，置于-80 ℃冰箱冷凍保存備用。以GADPH為內參，利用TaKaRa RR420A SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)進行qRT-PCR，以2-ΔΔCt法計算lncRNA-LINC01116的相對表達量。lncRNA-LINC01116上游引物序列：5′-CTTCTTTCCCTCCAAGTGAT-3′，下游引物序列：5′-TTAGCAAGTCAGCAAGTCCT-3′；GADPH上游引物序列：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物序列：5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.3 患者預后隨訪 以患者術后出院為觀察起點，通過電話、電子通訊與復診相結合的手段對患者進行隨訪。隨訪截止于2017年10月，隨訪時間10～127個月。

2 結果

2.1 腦膠質瘤、正常組織lncRNA-LINC01116表達比較 腦膠質瘤、正常組織lncRNA-LINC01116的相對表達量分別為0.665±0.678、0.103±0.147，兩者比較，P<0.05。

2.2 lncRNA-LINC01116表達與腦膠質瘤臨床病理參數的關系 結果見表1。由表1可知，lncRNA-LINC01116僅與腦膠質瘤患者臨床病理分級有關(P<0.05)，而與患者年齡、性別、是否發生腦積水、病理類型、腫瘤直徑、術前KPS評分、侵犯腦葉數目無關(P均>0.05)。

2.3 lncRNA-LINC01116表達與腦膠質瘤患者預后的關系 按照lncRNA-LINC01116相對表達量的平均數0.665為界，將95例患者分為低表達者41例和高表達者54例，繪制Kaplan-Meier生存曲線(見圖1)；低表達者生存率為73.17%(30/41)、生存時間為(100.30±6.91)個月，高表達者生存率為31.48%(17/54)、生存時間為(43.90±5.92)個月，兩者比較，P均<0.05；低表達者復發率為31.71%(13/41)，高表達者復發率為74.07%(40/54)，兩者比較，P<0.05。

表1 lncRNA-LINC01116表達與腦膠質瘤臨床病理參數的關系

圖1 腦膠質瘤患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

腦膠質瘤屬于浸潤性腫瘤，腫瘤細胞可向周圍正常組織滲透，與正常腦組織缺乏明確的分界，顯著增加了外科手術切除的難度，這是腦膠質瘤患者生存率低、預后差的主要原因[8]。此外，腦膠質瘤組織具有持續無限復制、血管快速生成以及免疫逃逸等特性，因而具有較強的侵襲與轉移能力[9]。腦膠質瘤是高度異質性腫瘤，放化療藥物難以對其進行準確定位，導致腦膠質瘤細胞對放化療具有高度耐受性[10]。因此，從基因與細胞層面上探究腦膠質瘤的發生發展機制，可為腦膠質瘤患者的個體化治療提供方向。

近期，Gao等[11]利用qRT-PCR技術檢測到lncRNA-HOXAAS2在腦膠質瘤組織與腦膠質瘤細胞系中的表達均異常升高，抑制lncRNA-HOXAAS2表達后，腦膠質瘤細胞的增殖、轉移、侵襲能力隨之減弱，且腦膠質瘤組織的血管生成也受到抑制；Wang等[12]發現，lncRNA-PAR5通過影響EZH2基因表達，促進腦膠質瘤細胞的增殖與轉移；lncRNA-MEG3則是通過Wnt/β-catenin途徑促進腦膠質瘤細胞的增殖[13]。然而Dong等[14]卻發現，抑制腦膠質瘤細胞中lncRNA-ANRIL表達，雖能減弱細胞的增殖、轉移與侵襲能力，但同時能促進細胞凋亡。以上研究結果表明，不同lncRNA可能通過影響不同基因、信號通路參與腦膠質瘤細胞的增殖、轉移與侵襲等過程。

據統計，人類基因組中超過90%的基因被轉錄為非編碼RNA。lncRNA是指其中長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA參與機體內多種生理進程，如表觀遺傳調控、RNA降解、miRNA沉默、細胞結構與組織的構建以及蛋白質定位的調控等[15～17]。研究[18～20]表明，lncRNA異常表達與多種疾病相關，尤其是惡性腫瘤[21,22]。lncRNA-LINC01116是一段長1 058 bp的基因，位于人體染色體2q31.1[23]。研究[24]發現，lncRNA-LINC01116能夠參與調控缺氧誘導的多種細胞炎癥因子的表達，從而參與缺氧相關的血管內皮細胞炎癥反應。而惡性腫瘤相關研究則發現，lncRNA-LINC01116能夠通過影響YAP1、VEGF、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達，參與非小細胞肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發生與發展[25]。

本研究顯示，lncRNA-LINC01116在腦膠質瘤組織中高表達，提示lncRNA-LINC01116可促進腦膠質瘤組織的形成與發展，與lncRNA-HOXAAS2、lncRNA-PAR5以及lncRNA-MEG3等的作用類似，均呈現促癌基因作用。本文結果顯示，lncRNA-LINC01116表達僅與腦膠質瘤患者病理分級相關，而與患者其他臨床病理參數均無關。腦膠質瘤是一種高度異質性腫瘤，不同組織亞型的腦膠質瘤的生物學特性相差較大，且由于本研究中的樣本數較少，導致并未發現lncRNA-LINC01116表達與患者年齡、性別、是否發生腦積水、病理類型、腫瘤大小、術前KPS評分以及侵犯腦葉數之間存在關聯。本研究還發現，lncRNA-LINC01116表達程度低的患者，具有較高的術后生存率、較長的生存時間以及較低的復發率，提示lncRNA-LINC01116高表達可以作為腦膠質瘤患者不良預后的指標之一。

總之，lncRNA-LINC01116在腦膠質瘤組織中異常高表達，其高表達提示較高的復發概率以及較差的預后。因此對于高表達lncRNA-LINC01116的腦膠質瘤患者，建議術后結合放療、化療等手段輔助治療，同時加強監測，預防復發，提高患者生存率，延長患者生存時間。