中國小麥主產區品種主要春化基因的組成與分布

李 哲，楊 杰，李瑞博，王曉龍，張曉科，張玲麗

(西北農林科技大學 農學院，陜西 楊凌 712100)

小麥是我國分布最為廣泛的糧食作物之一，在北緯22°～48°、海拔150～4 450 m的不同氣候和耕作條件下均有種植[1-2]。春化特性是小麥適應不同氣候條件的重要生理特性，影響小麥種植范圍，也決定適宜播期[3-5]。小麥春化特性主要受春化基因控制，研究春化基因及其等位變異對小麥育種、引種和推廣具有重要指導意義。

研究表明，小麥的春化特性受多個春化基因位點控制[6-8]，其中VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1和VRN-B3是研究比較深入的4個主要春化基因。VRN-A1位點存在3種顯性等位變異Vrn-A1a、Vrn-A1b和Vrn-A1c，其中Vrn-A1a對春化反應的影響最大，可完全消除春化需求[6]。VRN-B1位點至少存在3種顯性等位變異Vrn-B1a、Vrn-B1b和Vrn-B1c。VRN-D1存在3種顯性等位變異Vrn-D1a、Vrn-D1b和Vrn-D1c，顯性等位變異賦予了小麥不同程度春性特點[8-13]。VRN-B3位點已發現了3種顯性等位變異Vrn-B3a、Vrn-B3b和Vrn-B3c，其中Vrn-B3a和Vrn-B3c促進小麥提前抽穗開花，而Vrn-B3b推遲抽穗開花[9]。由此可知，不同位點不同等位變異春化基因對春化需求不同，決定了小麥冬春特性強弱差異，并通過不同等位變異組合調控小麥的春化發育特性[1-6,9-10]。中國幅員遼闊，南北氣溫差異、東西海拔差異很大，要求我國小麥品種對春化作用反應表型多樣化，以適應復雜的環境條件，因此研究不同地區小麥春化基因組成具有重要意義。本研究利用4個主要春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1和VRN-B3的相關分子標記，對中國小麥主產區品種的春化基因組成進行檢測，分析其春化基因的等位變異組成特點及其在不同麥區的分布特征，旨在為我國小麥品種選育和推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為中國小麥主產區的國審和省審品種，共276份。其中，東北春麥區9份，北部冬麥區40份，黃淮冬麥區113份，長江中下游冬麥區51份，西北春麥區21份和西南冬麥區42份，所選品種基本代表了我國小麥育種和生產現狀。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB法[14]提取小麥幼苗葉片基因組DNA，每個品種提取3份DNA作為生物學重復，保證結果的可靠性。

1.3 序列標志位點(STS)分子標記檢測及春化基因等位變異組成分析

春化位點檢測引物設計參考Fu等[10]、Yan等[9]、Milec等[12]、Zhang等[13]和Chen等[11]，并由上海生物工程有限公司合成。PCR反應體系為20 μL，其中基因組DNA 50 ng，10×buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Taq酶0.5 U。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸42～126 s，35個循環；72 ℃延伸8 min。引物組合VRN1AF/VRN1-INT1R、Intr1/B/F、Intr1/B/R3和Intr1/B/R4的擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(130 V電壓電泳40～60 min)，其他引物組合的擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(130 V電壓電泳25～30 min)，緩沖體系為1×TAE溶液，EB染色，凝膠成像系統成像，然后統計結果，并分析各品種春化基因的等位變異類型。

2 結果與分析

2.1 春化基因各位點的等位變異組成

2.1.1VRN-A1位點 引物VRN1AF、VRN1-INT1R對VRN-A1位點的檢測結果見圖1。圖1-A表明，德麥3號等20份材料擴增出965和876 bp 2條特異性條帶，推斷其VRN-A1位點為顯性等位變異Vrn-A1a(占7.2%)；甘麥8號等11份材料擴增出714 bp特異性條帶，說明VRN-A1位點為顯性等位變異Vrn-A1b(占4.0 %)；其余245份材料均擴增出734 bp的特異性條帶，表明VRN-A1位點可能含有隱性vrn-A1或顯性Vrn-A1c等位變異。進一步用另外2對引物Intr1/C/F、Intr1/AB/R和Intr1/A/F2、Intr1/A/R3分別對上述245份材料進行檢測，結果(圖1-B)顯示，只擴增出1 086 bp特異性條帶，未擴增出1 170 bp特異性條帶，說明其VRN-A1位點為隱性等位變異vrn-A1(占88.8%)?？傮w來看，VRN-A1位點隱性等位變異占88.8%；顯性等位變異占11.2%，其中顯性等位變異Vrn-A1a和Vrn-A1b分別占7.2%和4.0%。

2.1.2VRN-B1位點 利用引物Intr1/B/F、Intr1/B/R3和Intr1/B/R4的多重PCR體系，對VRN-B1位點進行檢測，結果見圖2。圖2表明，鄂麥17等28份材料擴增出709 bp特異性條帶，推斷VRN-B1位點為顯性等位變異Vrn-B1a(占10.1%)；鄭麥9023等22份材料擴增出673 bp特異性條帶，說明VRN-B1位點為顯性等位變異Vrn-B1b(占8.0%)；其余226份材料擴增出1 149 bp特異性條帶，表明VRN-B1位點為隱性等位變異vrn-B1(占81.9%)?？傮w來看，VRN-B1位點隱性等位變異占81.9%；顯性等位變異占18.1%，其中顯性等位變異Vrn-B1a和Vrn-B1b分別占10.1%和8.0%。

A.所用引物為VRN1AF與VRN1-INT1R；B.所用引物為Intr1/C/F與Intr1/AB/R；M.DL2000 Marker；1.德麥3號;2.J411;3.京冬8號；4.煙農18；5.遼春10號；6.靖麥7號；7.甘春20號;8.甘麥8號；9.中麥16；10.晉麥67；11.新春2號；12.新春26號A.The primers A are VRN1AF and VRN1-INT1R;B.The primers are Intr1/C/F and Intr1/AB/R;M.DL2000 Marker；1.Demai 3;2.J411;3Jingdong 8；4.Yannong 18；5.Liaochun 10；6.Jingmai 7；7.Ganchun 20;8.Ganmai 8；9.Zhongmai 16；10.Jingmai 67；11.Xinchun 2；12.Xinchun 26圖1 部分參試小麥品種VRN-A1位點的擴增結果Fig.1 PCR amplification fragments at VRN-A1 locus in several wheat cultivars

M.DL2000 Marker；1.中麥16；2.R57;3.云麥39；4.川育12；5.北麥10；6.隴春20；7.新春6號；8.鄂恩6號；9.石4158；10.鄂麥17；11.鄭麥9023；12.魯麥23M.DL2000 Marker；1.Zhongmai16；2.R57;3.Yunmai 39；4.Chuanyu 12；5.Beimai 10；6.Longchun 20；7.Xinchun 6；8.Een 6；9.Shi 4158；10.Emai 17；11.Zhengmai 9023；12.Lumai 23.圖2 部分參試小麥品種VRN-B1位點的擴增結果Fig.2 PCR amplification fragments at VRN-B1 locus in several wheat cultivars

2.1.3VRN-D1位點 利用引物Intrl/D/F、Intrl/D/R3和Intr1/D/R4的多重PCR體系，對VRN-D1位點進行檢測，結果表明，川麥47等120個品種擴增出1 671 bp特異性條帶，推斷VRN-D1位點為顯性等位變異；進一步利用互補性標記(VRN1DF/VRN1-SNP161CR和VRN1DF/VRN1-SNP161A-R)對這120份VRN-D1顯性等位變異類型進行檢測，其中111份材料為Vrn-D1a顯性等位變異(40.2%)，9份材料為Vrn-D1b顯性等位變異(占3.3%)。其余156個品種擴增出997 bp特異性條帶，說明這些品種可能含有隱性vrn-D1或顯性Vrn-D1c等位變異，再利用引物VRN1DF/VRN1-SNP161CR對這156份材料進一步檢測，結果(圖3)發現，襄麥25等3個品種擴增出787 bp特異性條帶，說明這些材料為顯性等位變異Vrn-D1c(占1.1%)，而周麥16等153份材料擴增出612 bp特異性條帶，說明這些材料為隱性等位變異vrn-D1(占55.4%)?？傮w來看，VRN-D1位點隱性等位變異占55.4%；顯性等位變異占44.6%，其中顯性等位變異Vrn-D1a、Vrn-D1b和Vrn-D1c分別占40.2%，3.3%和1.1%。

所用引物為VRN1DF與VRN1-SNP161CR；M.DL2000 Marker；1.豐抗2號；2.淮麥18；3.豫麥57；4.襄麥25；5.皖麥19；6.豫麥50；7.周麥16；8.泰山1號；9.繁105；10.龍輻麥17；11.甘春16號；12.變異4號The primers are VRN1DF and VRN1-SNP161CR；M.DL2000 Marker；1.Fengkang 2；2.Huaimai 18；3.Yumai 57；4.Xiangmai 25；5.Wanmai 19；6.Yumai 50；7.Zhoumai 16；8.Taishan 1；9.Fan 105；10.Longfumai 17；11.Ganchun 16；12.Bianyi 4圖3 部分參試小麥品種VRN-D1位點的擴增結果Fig.3 PCR amplification fragments at VRN-D1 locus in several wheat cultivars

2.1.4VRN-B3位點 利用引物VRN4-B-INS-F和VRN4-B-INS-R對VRN-B3位點進行檢測，結果表明，僅遼春10號擴增出1 200 bp特異性條帶，說明該品種為顯性等位變異Vrn-B3a(占0.4%)；利用引物VRN4-B-NOINS-F和VRN4-B-NOINS-R對其余的275個品種檢測，結果(圖4)發現，僅短紅芒麥品種擴增出2 030 bp特異性條帶，為顯性等位變異Vrn-B3b(占0.4%)，其余274個品種擴增出1 140 bp特異性條帶，為隱性等位變異vrn-B3(占99.2%)?？傮w來看，VRN-B3位點隱性等位變異占99.2%；顯性等位變異占0.8%，其中顯性等位變異Vrn-B3a和Vrn-B3b均占0.4%。

所用引物為VRN4-B-NOINS-F 與VRN4-B-NOINS-R；M.DL2000 Marker；1.小偃54；2.短紅芒麥；3.冀麥38；4.荔墾2號；5.西農336；6.濟南17；7.碧螞4號；8.蚰子麥；9.揚麥158；10.川麥42；11.墨沙；12.南原1號The primers are VRN4-B-NOINS-F and VRN4-B-NOINS-R；M.DL2000 Marker；1.Xiaoyan 54；2.Duanhongmangmai；3.Jimai 38；4.Liken 2；5.Xinong 336；6.Jinan 17；7.Bima 4；8.Youzimai；9.Yangmai 158；10.Chuanmai 42；11.Mosha；12.Nanyuan 1圖4 部分參試小麥品種VRN-B3位點的擴增結果Fig.4 PCR amplification fragments at VRN-B3 locus in several wheat cultivars

2.2 春化基因各位點等位變異在不同麥區的分布特點

在276份品種中，4個主要春化基因位點之間顯性等位變異的分布頻率不同，由高到低的順序為VRN-D1(44.6%)>VRN-B1(18.1%)>VRN-A1(11.2%)>VRN-B3(0.8%)。4個主要春化基因位點顯性等位變異在不同麥區的分布頻率見表1。

表1 4個主要春化基因位點顯性等位變異在不同麥區的分布頻率Table 1 Distribution of allele at four loci of vernalization genes in different wheat regions

注：Ⅰ.北部冬麥區；Ⅱ.黃淮冬麥區；Ⅲ.長江中下游冬麥區；Ⅳ.西南冬麥區；Ⅴ.東北春麥區；Ⅵ.西北春麥區。下同。
Note:Ⅰ.Northern winter wheat region；Ⅱ.Huanghuai winter wheat region；Ⅲ.Yangzi River winter wheat region；Ⅳ.Southwestern winter wheat region；Ⅴ.Northeastern spring wheat region；Ⅵ.Northwestern spring wheat region.The same below.

由圖1可知，春化基因在各麥區中的分布頻率有很大差異，其中顯性等位變異Vrn-A1分布頻率從高到低依次為東北春麥區(100.0%)>西北春麥區(76.2%) >西南冬麥區(7.1%)>長江中下游冬麥區(5.9%)>北部冬麥區(0.0%)=黃淮冬麥區(0.0%)；顯性等位變異VRN-B1分布頻率依次為東北春麥區(88.9%)>西北春麥區(66.7%)>西南冬麥區(35.7%)>黃淮冬麥區(8.8%) >長江中下游冬麥區(5.9%)>北部冬麥區(0.0%)；顯性等位變異VRN-D1分布頻率依次為長江中下游冬麥區(92.2%)>西南冬麥區(88.1%)>東北春麥區(66.7%)>西北春麥區(33.3%)>黃淮冬麥區(23.0%)>北部冬麥區(0%)；276份小麥品種中VRN-B3主要以隱性等位變異類型vrn-B3組成(99.2%)，其顯性等位變異類型分布很少。

2.3 春化基因等位變異的組合及其分布特點

在276份小麥品種中，4個春化基因位點共存在9種等位變異組合類型(表2)，不同等位變異組合類型的總體分布比例不同，以vrn-A1/vrn-B1/VRN-D1/vrn-B3組合類型比例最高(33.7%)。不同等位變異組合類型在各麥區中的分布頻率也有很大差異，其中北部冬麥區品種的春化基因全部為隱性等位變異組合類型；在黃淮冬麥區、長江中下游冬麥區和西南冬麥區中，VRN-D1位點為顯性等位變異的組合類型在品種內占主導地位；在東北春麥區和西北春麥區，品種的春化基因組合主要以VRN-A1和VRN-B1位點同時為顯性等位變異的組合形式存在。

表2 4個主要春化基因位點不同等位變異組合的分布頻率Table 2 Distribution of allelic combination at four loci of vernalization genes %

3 討 論

依據自然條件、耕作特點及小麥的生態型等，我國小麥種植區域被劃分為10個麥區[15]。不同麥區小麥品種的春化基因組成差異反映了不同環境對品種春化特性的要求，是小麥環境適應性的分子基礎。小麥的春化特性受多基因調控的復雜生理過程決定[3-5]，其中顯性春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1對低溫春化的要求不同，攜帶VRN-A1的小麥品種不需要春化就能抽穗開花，攜帶VRN-D1的小麥品種需要一定春化作用，VRN-B1介于兩者之間[16]。本研究結果表明，我國小麥品種春化基因顯性等位變異中VRN-D1所占比例(44.6%)最高，并在6大麥區均有分布，表明在中國小麥品種中控制春化特性的主要是對春化作用需求較強的VRN-D1；而不需要春化作用的顯性等位變異VRN-A1主要分布在東北春麥區和西北春麥區；需求較弱的VRN-B1，除北部冬麥區外均有分布，分布比例由低緯度向高緯度遞增。與姜瑩等[17]研究結果不同的是，本研究長江中下游冬麥區品種出現了VRN-A1和VRN-B1位點的顯性等位變異，比例均為5.9%；黃淮冬麥區品種出現了VRN-B1位點顯性等位變異品種，分布頻率為8.8%，說明近年來隨著氣候變暖，顯性春化基因VRN-A1和VRN-B1可能通過后期育種已導入到了這些地區的小麥品種內。

冬小麥是我國最主要的小麥類型。對于年平均和年極端溫度低、冬季最冷月(1月)平均氣溫低和無霜期較短的地區，秋播小麥無法安全越冬，需要種植春小麥。與冬小麥相比，春小麥生育期短，苗期溫度較高或低溫時間較短，因此春麥區需要種植春性較強的品種。從6個麥區小麥生產實踐來看[18]，東北春麥區(生育期75～95 d)和西北春麥區(生育期100～130 d)等春麥區小麥生育期較短，并隨緯度增高而變短；長江中下游冬麥區(生育期181～218 d)、西南冬麥區(生育期180～220 d)、黃淮冬麥區(生育期225～260 d)、北部冬麥區(生育期270～280 d)等冬麥區小麥生育期相對較長，并隨緯度增高而延長。小麥為了適應地區氣候等條件要求，春化基因組成表現出相應特點。在東北春麥區和西北春麥區，品種多以對春化作用不敏感的VRN-A1和VRN-B1位點的顯性等位變異組合為主，比例大體隨著緯度的增大而增加，品種春性特性增強，與生育期縮短相吻合。在黃淮冬麥區、西南冬麥區和長江中下游冬麥區，品種春化基因組成類型以對春化需求較弱的VRN-D1位點顯性等位變異占主導地位，并隨緯度增高而遞減，品種冬性逐漸增加，抗冬性增強，生育期延長。

因分子標記限制，本研究只完成了我國主產麥區小麥品種春化基因VRN-A1、VRN-B1、VRN-D1、VRN-B3位點組成分析，隨著其他春化基因如VRN2和VRN4位點研究的深入，對這些位點基因組成進行分析，將可全面解釋我國小麥對春化反應的分子組成特點，更好地為小麥育種和推廣提供理論依據。