奶牛源金黃色葡萄球菌臨床分離株的耐藥特性、生物膜及其相關基因分布研究

伍曄暉，孟慶玲，喬 軍 *，蔡擴軍，王登峰，孟 丹，馬 帥，李重陽，才學鵬

(1. 石河子大學動物科技學院， 新疆 石河子 832003； 2. 烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆 烏魯木齊 830063；3. 新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆 烏魯木齊 830000；4. 中國農業科學院蘭州獸醫研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】奶牛乳房炎和子宮內膜炎是奶牛最常見和最高發的疾病之一，給奶牛養殖業造成了嚴重的經濟損失。病原學調查發現，引起奶牛乳房炎和子宮內膜病原種類多樣，其中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是引起上述炎性疾病的主要病原菌之一[1]?！厩叭搜芯窟M展】目前，抗生素是治療奶牛SA感染的主要手段[2]。然而，由于畜牧業生產中抗菌藥物不合理的濫用現象，導致SA耐藥菌株逐年增多，致使抗生素療法的治愈率降低[3]。與此同時，由于抗生素在乳中的殘留，致使鮮奶受到一定程度的耐藥菌株和抗生素污染，導致牛奶的品質下降，并且耐藥菌株和耐藥基因可通過奶制品傳播給人群，給人們的身體健康帶來嚴重的威脅[4]。作為最重要的人獸共患食源性細菌之一，近年來隨著抗菌藥物的濫用SA耐藥菌株不斷增多，尤其是耐甲氧西林SA(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的大量出現，給奶牛乳房炎和子宮內膜炎的防治帶來了更大的困難[5]?！颈狙芯壳腥朦c】研究發現，SA生物膜的形成能力與SA菌株毒力和耐藥性密切相關，許多MRSA流行株不僅具有多重耐藥性，還具有形成生物膜的能力，致使細菌的毒力進一步增強[6-7]。黏附素具有使MRSA黏附到宿主靶細胞的作用，其黏附能力對MRSA的感染及生物膜的形成起著重要作用[8]?！緮M解決的關鍵問題】新疆是我國重要的奶源地之一，牛奶產量位居西部地區前列。為了了解新疆地區MRSA流行株的耐藥情況和生物膜的形成能力及其相關基因的分布情況，本實驗對奶牛源MRSA新疆流行株的耐藥表型和生物膜及其相關基因進行了檢測研究，為MRSA分子流行病學調查和臨床合理用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Baird-Parker培養基、BHI液體培養基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)均購自青島高科園海博生物技術有限公司；大腸桿菌 (E.coli) DH5α菌種由本實驗室保存；細菌基因組DNA提取試劑盒、pMD19-T載體、DNA Marker均購自TaKaRa公司；生化化鑒定管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物紙片購自杭州微生物試劑有限公司；結晶紫購自天津市北聯精細化學品開發有限公司；96孔微孔板購自上海市蔚宏生物科技有限公司。

1.2 奶牛乳樣品的采集

在2015年1月至2017年5月期間，從新疆五家渠、石河子、沙灣、瑪納斯、阿克蘇5個地區的規?；膛龇謩e采集臨床型乳房炎牛乳及子宮內膜炎膿液樣品386份，通過溫水清洗乳房、肛門及外陰部，并使用75 %酒精棉球對其進行消毒處理，收集第3把奶后的奶樣及子宮內容物分別放于滅菌的試劑管中，置于冰盒內，運送實驗室進行分離培養。

1.3 SA分離鑒定

將采集的樣品接種于Baird-Parker培養基，放于37 ℃恒溫箱培養12～48 h。挑取具有典型特征的單菌落，在營養瓊脂培養基上進行純化培養。對純化菌進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，然后隨機選取分離株用SA生化鑒定管測定其生化反應特性；根據GenBank中已公布的SA 16S rRNA的序列設計通用引物，對SA分離株進行16SrRNA序列比對分析。將分離鑒定的SA在BHI肉湯中37 ℃培養24 h，再將500 μl 所得新鮮菌液加入到500 μl 40 %甘油中震蕩混合均勻制成20 %甘油菌，-20 ℃保存備用。

1.4 SA分離株藥敏試驗及MRSA鑒定

用無菌接種環挑取單個菌落，接種于BHI培養液于37 ℃培養20～24 h，再用滅菌生理鹽水將細菌濃度調至0.5麥氏濁度，取200 μl菌液，均勻涂布于MHA培養基，涂布均勻后貼上15種藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片使其與培養基表面緊密接觸。放入37 ℃恒溫培養箱中培養48 h后測量抑菌圈直徑。通過藥敏試驗，初步判定30 μg頭孢西丁抑菌環直徑≤21 mm的菌株為MRSA；采用PCR方法(檢測MecA基因)進一步篩選和鑒定MRSA流行株，引物設計參照文獻[9]。

1.5 MRSA和MSSA菌株基因組DNA的提取

抽取MRSA和MRSA流行株接種至無菌BHI培養液于37 ℃振蕩過夜，取1.5 mL細菌培養液于無菌EP管內，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，余下操作嚴格按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。DNA產物在1 %瓊脂糖凝膠上電泳進行檢測。

1.6 MRSA和MSSA生物膜的檢測

采用改良微量孔板法檢測SA不同分離株生物膜形成能力。用無菌接種環挑取單個菌落，接種于TSB培養基中，振蕩過夜。將活化的菌液以1∶100的比例轉接于TSB肉湯中繼續培養，使其OD600mm達到0.2左右，分別吸取菌液200 μl加入到96孔微孔板中，每株分別移入8個平行孔中，靜置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h；然后用微量移液器吸去孔中的培養基，加入200 μl無菌蒸餾水洗滌微孔板重復3次，置于室溫條件下干燥45 min，然后向每個孔中加入150 μl濃度為1 %的結晶紫溶液在室溫條件下染色30 min，棄去染色液，再加入200 μl無菌蒸餾水洗滌微孔板4次，在空氣中干燥30 min；再向每個孔中加入150 μl濃度為95 %的乙醇溶液脫色30 min，用酶標儀測定其OD570nm；將脫色后的微孔板直接放在倒置顯微鏡下觀察生物膜的形態，拍照記錄。

1.7 MRSA和MSSA生物膜形成相關基因的檢測

2 結果與分析

2.1 SA分離鑒定

從新疆5個地區采集到386份臨床型乳房炎牛乳及子宮內膜炎膿液樣品中共分離出164株SA。SA在Baird-Parker培養基上長出灰或黑色菌落，菌落周圍有一渾濁帶，挑取的單菌落經革蘭氏染色鏡檢后可見像葡萄樣串狀紫色球菌(圖1)。生化鑒定結果顯示，SA能發酵蔗糖、乳糖、蕈糖、果糖、甘露糖、麥芽糖，缺氧環境中產酸不產氣，尿素、精氨酸水解，乙酰葡糖胺、硝酸鹽還原反應陽性，VP反應弱陽性，木糖、木醇、蜜二糖、山梨醇反應陰性。

2.2 16SrRNA序列比對分析

對分離株SA-xj45、SA-xj46、SA-xj47、SA-xj64、SA-xj65、SA-xj66、SA-xj75與SA標準株S.aureusECNU-UA1，大腸桿菌標準株E.coliATCC35469、E.coli51Sh，鏈球菌標準株S.Oligoferm-entansAS1.3089、S.australisChDCB189，綠膿桿菌標準株P.aeruginosaNAPCC-1、P.aeruginosaATCC 19660，腸炎沙門氏菌標準株S.entericaATCC9150、S.entericaLGS4進行16SrRNA序列比對分析，結果顯示分離株與SAS.aureusECNU-UA1親緣性最近，同源性達96 %，與大腸桿菌、鏈球菌、綠膿桿菌、腸炎沙門氏菌親緣性相對較遠(圖2)。

A：SA在Baird-Parker培養基的菌落形態；B：革蘭氏染色鏡檢SA菌體圖1 SA分離株菌落及鏡檢形態Fig.1 Colony morphology of SA in Baird-Parker and gram staining

圖2 16SrRNA序列比對結果Fig.2 Results of sequence alignment of 16SrRNA

7.苯唑西林8.青霉素9.紅霉素10.頭孢西丁11.四環素12.利福平7.Oxacillin; 8.Penicillin; 9.Erythromycin; 10.Cefoxitin; 11.Tetracycline 12. Rifampicin圖3 MRSA(A)和MSSA(B)藥敏試驗結果Fig.3 Assay of drug susceptibility of MRSA(A) and MSSA(B) isolates

圖4 MRSA與MSSA對抗菌藥物的耐藥率Fig.4 Drug resistance rates of MRSA and MSSA isolates

2.3 MRSA檢出率及藥敏試驗

164株SA中檢出22株MRSA，MRSA檢出率為13.41 %，其余均為MSSA流行株。MRSA對抗菌藥物的耐藥表型明顯多于MSSA(圖3)；MRSA對多種抗菌藥物的耐藥率也明顯高于MSSA(圖4)。

2.4 MRSA生物膜生成能力測定

通過酶標儀測定OD570nm，結果顯示，在24 h時MRSA和MSSA生物膜生成能力差異顯著(P<0.05)，MRSA菌株的生物膜生成能力顯著高于MSSA菌株(圖5～6)。通過倒置顯微鏡觀察在24 h時，MRSA和MSSA菌株都生成了典型的生物膜形態，MRSA菌株生物膜厚度顯著高于MSSA菌株(圖6)。

2.5 MRSA和MSSA生物膜形成相關基因的檢測

生物膜形成相關基因檢測結果顯示，MRSA菌株clfA 、clfB、fnbA、fnbB、Fib、cna、FnBP基因檢出率分別為100 %(n=22)、95.45 %(n=21)、40.91 %(n=9)、90.91 %(n=20)、86.36(n=19)、54.55

%(n=12)、54.55 %(n=12)；除基因fnbA，其余檢出率均高于MSSA菌株(圖7～8)。

3 討 論

大量耐藥性菌株的出現已經成為SA性奶牛乳房炎防控的瓶頸[11]。藥物敏感性監測不僅可以反映SA的耐藥現狀，同時也為此病的治療提供用藥依據。本研究中，在奶牛臨床乳房炎樣品中MRSA的檢出率達13.41 %，所有MRSA菌株均耐青霉素和頭孢西丁。與MSSA相比，MRSA菌株對紅霉素、克林霉素、四環素、甲氧芐啶、左氧氟沙星的耐藥率明顯增高，同時還出現了對環丙沙星、氯霉素、慶大霉素的耐藥菌株，且同一株菌出現耐多種抗生素的情況，提示SA流行株耐藥性十分嚴峻。本研究結果顯示，MRSA菌株對利福平的耐藥率有所升高，可能由于自發性突變和在生產中經常使用氟喹諾酮類藥物的共同作用[12]。MRSA菌株對呋喃妥因、替考拉寧、磷霉素的耐藥率低于19 %，這可能與臨床較少使用有關，可作為治療SA感染引起的奶牛乳房炎和子宮內膜炎的優選藥，特別適用于治療MRSA和β-內酰胺類耐藥株的嚴重感染。

圖5 MRSA與MSSA分離株生物膜檢測結果(OD570nm)Fig.5 Biofilm determination of MRSA and MSSA isolates (OD570nm)

A與B：倒置顯微鏡下呈現的生物膜形態(400)；C與D：96孔微孔板中乙醇脫色后小孔A and B: The biofilm morphology under inverted microscope(400 );C and D: 96-well polystyrene microtiter plates after decolorization of ethanol圖6 MRSA與MSSA分離株形成的生物膜Fig.6 Formation of biofilm by MRSA (A/C) and MSSA(B/D) isolates

M.DNA標志物(DL-2000); 1.陰性對照; 2. clfA基因(104 bp); 3. clfB基因(194 bp); 4. fnbA:基因(133 bp); 5. fnbB(197 bp); 6. Fib基因(239 bp); 7. cna基因(156 bp); 8. FnBP基因(1500 bp)M.DNA marker 2000; 1. Negative control; 2. clfA gene; 3. clfB gene; 4. nbA gene; 5. fnbB gene; 6. Fib gene; 7. cna gene; 8. FnBP gene圖7 MRSA菌株檢測黏附素電泳結果Fig.7 Electrophoresis result of adhesin in MRSA isolates

圖8 MRSA與MSSA菌株生物膜相關基因陽性分布Fig.8 Positive distribution of biofilm related genes in MRSA and MSSA isolates

研究表明，細菌生物膜(bacterial biofilm，BBF)可以通過形成特殊結構以逃避宿主免疫系統對其的清除作用，還可通過抗生素滲透限制、營養限制和形成特殊表型來抵抗抗生素，因此，BBF的形成是細菌產生耐藥性的主要因素，也是動物和人類發生持續性感染的重要因素[13-15]。本研究結果顯示，MRSA菌株的生物膜生成能力均顯著高于MSSA菌株(P<0.05)，且MRSA菌株比MSSA菌株表現出多重耐藥和較強的抗性。由此可知，SA菌株的生物膜生成能力與其耐藥性密切相關。

在BBF形成過程中，細菌的群體感應(QS)系統可通過合成和分泌自誘導分子(AI)的濃度來控制整個細菌群體，當AI濃度隨著細菌群體密度達到一定閾值時，即可啟動特異性基因的表達，使細菌對外界環境刺激做出反應，以增強細菌群體的生命力，導致細菌侵襲力和致病性明顯增強[16-17]。本研究結果顯示，超過90 %的MRSA菌株攜帶凝聚因子A(clfA)和B(clfB)、纖連蛋白結合蛋白B(fnbB)；大多數MRSA菌株攜帶纖維蛋白原結合蛋白(Fib)、膠原結合蛋白(cna)。有研究指出，fnbA、fnbB介導的生物膜形成是MRSA生物膜形成的主要途徑；clfA基因在乳酸乳球菌中表達后，使得菌株毒力增強[18-19]。由本研究結果可知，在MRSA菌株中，fnbB 的檢出率遠高于fnbA，且clfA的檢出率高達100 %，由此推測clfA、fnbB在MRSA生物膜的形成中具有更為重要的作用。國外學者Szezuka等[20]收集了80株臨床MRSA菌株進行生物膜相關基因檢測，結果超過50 %的菌株攜帶fnbB基因，但未檢測出fnbA基因，這與本研究的實驗結論相一致。此外，SA表面黏附素在生物膜生產中同樣起著重要的作用。本研究結果顯示，MRSA菌株clfA 、clfB、fnbB、Fib、cna、FnBP基因檢出率均高于MSSA菌株，提示這與MRSA菌株較強的生物膜生成能力及其較強抗性具有相關性。由于不同的生物膜相關基因的表達水平可能存在差異[21]，因此有必要對生物膜形成相關基因在MRSA菌株中的表達水平進行檢測。MRSA較強的生物膜生成能力、黏附素的高攜帶率與MRSA毒力之間的相關性尚需進一步開展動物試驗研究。

4 結 論

在臨床用藥時，可將呋喃妥因、替考拉寧、磷霉素作為優選藥用于治療SA引發的奶牛乳房炎、子宮內膜炎及MRSA和β-內酰胺類耐藥株引起的嚴重感染。MRSA菌株比MSSA菌株具有較強的生物膜形成能力，clfA 、clfB、fnbB、Fib、cna、FnBP基因在其中發揮著重要作用。MRSA菌株較強的生物膜形成能力及其較強抗性之間具有相關性。