氟苯尼考β-環糊精包合物中試產品的質量評價

胡 帥，李凌峰，李靈娟，袁富威

(河南牧翔動物藥業有限公司，河南鄭州 451164)

氟苯尼考(florfenicol)為酰胺醇類動物專用廣譜抗生素，其抗菌活性明顯優于氯霉素和甲砜霉素。目前該藥在獸醫臨床上應用非常廣泛，但該藥難溶于水,口服生物利用度很低。因此，如何通過制劑技術提高該藥的溶解度及溶出速率對于氟苯尼考的臨床應用具有重要意義。

自從1903年首次從發酵液成功提取出β-環糊精以來，研究人員在環糊精的制備、性質和應用等方面取得了巨大的進展。特別是近年來，環糊精及其衍生物在藥學中的應用引起了研究人員的極大興趣。藥物環糊精包合物在提高藥物的溶解度、溶出速度、生物利用度等方面顯示出獨特的性能和應用價值[1]。

關于氟苯尼考β-環糊精包合物在實驗室研究方面已有一些報道，如采用飽和溶液法[2-6]和超聲波法[7]制備出氟苯尼考β-環糊精包合物，但仍然存在以下問題：包合物評價體系不完善、包合率測定方法不恰當、不能綜合評價氟苯尼考β-環糊精包合物。因此，有必要建立一種完善的氟苯尼β-環糊精的評價體系，來指導氟苯尼考β-環糊精包合物的中試轉化。筆者采用超聲波-離心噴霧干燥中試生產工藝，以β-環糊精為包含材料制備包合物，通過薄層色譜法、X-射線粉末衍射法、高效液相色譜法對氟苯尼考β-環糊精包合物進行質量評價。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料。氟苯尼考對照品(中國獸醫藥品監察所)；氟苯尼考 (浙江康牧藥業有限公司)；β-環糊精(山東新大生物科技有限公司)；溴化鉀(光譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)。

1.1.2儀器。1206型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；LPG300高速離心噴霧干燥機(無錫市能達干燥設備有限公司)；X射線衍射儀D8 FOCUS(德國布魯克公司)；GoodSee薄層色譜成像儀(上?？普苌萍加邢薰?；KC7000W超聲波機(濟寧科源超聲波設備有限公司)。

1.2氟苯尼考含量的測定采用高效液相色譜法[8]測定氟苯尼考含量。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水-冰醋酸(100∶197∶3)為流動相；檢測波長為224 nm；取樣品適量，精密稱定，加入流動相溶解并定量稀釋成每毫升約含50 μg的溶液，作為供試品溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取氟苯尼考對照品，采用相同方法測定。采用外標法，根據峰面積計算氟苯尼考含量。

1.3氟苯尼考β-環糊精包合物鑒別

1.3.1薄層色譜法。取樣品約1 g，置于燒杯中，加入50 mL 無水乙醇，超聲10 s后離心棄去上清，將沉淀溶解后再加入50 mL 無水乙醇，重復上述操作，重復2次。收集沉淀物，于60 ℃下烘干。取包合物烘干物適量(約相當于氟苯尼考5 mg)，置于2 mL離心管中，加入1 mL水使其溶解，得到供試品溶液A；采用相同方法制得物理混合物烘干物，加入流動相溶解得到溶液B。取氟苯尼考對照品適量，加入甲醇制成10 mg/mL氟苯尼考溶液，作為對照品溶液。吸取上述A、B溶液各2 μL，對照品溶液1 μL分別點于同一硅膠GF254板上，以氯仿-甲醇-乙酸乙酯-水(15∶6∶15∶1)為展開劑，展開后晾干，置于紫外燈(GF254)下檢視。供試品溶液A所顯示斑點位置應與對照品相同，供試品溶液B不顯示斑點。

1.3.2X-射線粉末衍射法[9]。取供試品，采用X-射線粉末衍射法分析。試驗條件如下：輻射源CuKα，管電壓40 kV，管電流60 mA；入射狹縫0.6 mm，索拉狹縫4°；掃描速度0.2 s/step；掃描步長0.02°。

1.4氟苯尼考β-環糊精收率和包合率的測定

1.4.1氟苯尼考β-環糊精收率的測定。按照以下公式計算氟苯尼考β-環糊精的收率：

1.4.2氟苯尼考β-環糊精包合率的測定。取制得的氟苯尼考β-環糊精包合物，按照“1.2”的方法進行含量測定，得到總的氟苯尼考含量C總。另取氟苯尼考β-環糊精包合物 1 g，加入50 mL 無水乙醇，超聲10 s后離心棄去上清，將沉淀溶解后再加入50 mL 無水乙醇，重復上述操作，重復2次。收集沉淀物，置于60 ℃條件下烘干，按照“1.2”的方法測定烘干物的含量，得到包合的氟苯尼考含量C包合。按照以下公式計算氟苯尼考β-環糊精的包合率：

2 結果與分析

2.1氟苯尼考β-環糊精包合物的制備參照筆者發明專利[10]中的制備方法進行中試，分3批進行。稱取氟苯尼考40 kg和β-環糊精160 kg，加入反應釜中，加入純化水600 kg，于100 ℃下恒溫加熱溶解，得到料液A；使用超聲儀，以50 Hz的頻率對料液A超聲2 h，得到料液B；使用LPG型高速離心干燥機對料液B進行離心噴霧干燥，干燥產物即為氟苯尼考-β-環糊精包合物，干燥參數設置如下：離心盤轉速22 000 r/min，進風溫度150 ℃。

2.2氟苯尼考β-環糊精包合物鑒別結果

2.2.1薄層色譜法鑒別結果。從圖1可以看出，包合物中的氟苯尼考由于被包合而未能被洗液洗去，包合物供試品(圖1B)與對照品(圖1A、D)相同位置可見清晰斑點，分離效果好；氟苯尼考與β-環糊精混合物(圖1C)中游離的氟苯尼考全部被洗去，故不顯示斑點。此鑒別方法不僅鑒別出氟苯尼考，而且能將包合物與混合物區分開來。

2.2.2X-射線粉末衍射法鑒別結果。氟苯尼考、β-環糊精、氟苯尼考β-環糊精混合物、氟苯尼考-β-環糊精包合物的X-射線衍射圖分別見圖2。從圖2可以看出，氟苯尼考β-環糊精物理混合物衍射圖峰(圖2C)為氟苯尼考(圖2A)和β-環糊精(圖2B)衍射峰的疊加；包合物呈現典型的無定型衍射圖(圖2D)，氟苯尼考和β-環糊精的結晶衍射峰均已消失，表明氟苯尼考以無定型或分子形式包合，形成了氟苯尼考β-環糊精包合物，包合形式為分子包合。

注：A、D.氟苯尼考對照品；B.氟苯尼考β-環糊精包合物；C.氟苯尼考與β-環糊精混合物Note：A，D.Florfenicol reference substance；B.Florfenicol β-cyclodextrin inclusion complex；C.Mixture of florfenicol and β-cyclodextrin inclusion圖1 氟苯尼考包合物薄層鑒別圖Fig.1 TLC identification results of florfenicol inclusion complex

圖 2 氟苯尼考(A)、β-環糊精(B)、氟苯尼考β-環糊精混合物(C)、氟苯尼考β-環糊精包含物(D)的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction diagram of florfenicol(A)，β-cyclodextrin(B)，mixture of florfenicol and β-cyclodextrin(C)，florfenicol-β-cyclodextrin inclusion complex(D)

2.3氟苯尼考β-環糊精包合物的收率和包合率制得3批氟苯尼考β-環糊精包合物，測得平均收率為(98.20±0.37)%,平均包合率為(95.10±1.28)%。3批氟苯尼考β-環糊精包合物的收率和包合率都較高，批間精密度較好。

3 結論

氟苯尼考β-環糊精鑒別方法有傅里葉紅外光譜法、X射線粉末衍射法和差示掃描量熱法。傅里葉紅外光譜法測定樣品時基線易漂移，重復性差；X射線粉末衍射法和差示掃描量熱法只能證實有新的物相產生，不能直接證實包合物的產生及產物的包合率，目前這些鑒別方法在藥典中只作為藥物的輔助鑒別方法。薄層色譜方法作為藥典中普遍采用的特征性鑒別方法，具有專屬性強和易操作等優點。

包合率作為包合物的最重要指標，是判斷包合工藝質量的重要指標。羅娟等[3]報道了氟苯尼考β-環糊精的包合率測定方法，但其實際測定的是氟苯尼考原料的回收率，而不是氟苯尼考β-環糊精包合率。該研究通過將游離氟苯尼考與包合氟苯尼考分離，建立了氟苯尼考β-環糊精包合率的測定方法，可以科學評價產物中氟苯尼考β-環糊精的純度。

該研究建立了氟苯尼考β-環糊精薄層色譜法和包封率的測定方法，結合X射線粉末衍射法和高效液相色譜法完善了氟苯尼考β-環糊精的評價方法。通過該評價體系，有效指導了氟苯尼考β-環糊精的中試生產。包合率低和缺乏大生產設備是制約氟苯尼考β-環糊精包合物擴大化生產的兩大主要因素。該試驗結果表明，采用超聲波-離心噴霧干燥法中試制備的產物為氟苯尼考β-環糊精包合物，收率為98.2%，包合率為95.1%；收率和包合率均較高，較好地解決了上述兩大問題，該中試制備工藝簡單可控，重復性好，可擴大化生產，具有較好的工業化前景。