紅樹莓果酒澄清工藝的優化及理化指標的測定

夏天奇，高新亞，劉小琳，王 晴，王金玲*

（1.東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業大學 工商管理學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅樹莓（Rubus idaeusL.）為薔薇科懸鉤子屬的木本植物，是一種藥食同源的聚合漿果，因其富含花青素、黃酮、鞣花酸、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等天然活性成分，對癌癥、肥胖[1]、糖尿病、心血管疾病、神經變性、黃斑變性、炎癥損傷[2]等疾病有顯著抑制作用，能有效預防衰老[3]，因此被列為世界第三代水果，已成為食品、保健品的研究焦點[4]，在化妝品、醫藥等方面有廣泛應用價值。

紅樹莓果實出汁率較高，以其為原料釀制的果酒具有典型的樹莓果香與發酵酒香，酒體豐滿，是營養價值極高的低度保健酒[5]。而紅樹莓果酒中含有的果膠質、蛋白質[6]、色素、單寧等大分子物質，在加工、儲存過程中易產生渾濁[7]，嚴重影響果酒的澄清度及品質。

澄清劑皂土吸水膨脹后，每克皂土約有750 m2的表面積，此外，皂土中硅氧四面體或鋁氧八面體可形成負電性吸附中心[8]，因此，當皂土以溶膠的形式懸浮于果酒中時，可通過范德華力和負電荷作用吸附大量正電性蛋白質，鐵、銅離子，色素和其他膠體粒子，通過沉降作用澄清果酒，同時提高果酒品質，增強果酒對銅破敗病以及褐變的抵抗能力。MIHUCZ V G[9]等研究發現，在乙醇濃度12%和pH 3.56時皂土有最大澄清效果，適于偏酸性果酒的澄清。目前國內關于紅樹莓果酒的澄清研究主要有果膠酶[10]、復合澄清劑[11]兩方面，而對皂土的系統深入研究鮮少。本研究采用皂土對紅樹莓果酒進行澄清處理，采用單因素及響應面試驗優化澄清工藝，并探討澄清前后果酒的酒精度、總糖、滴定酸、總酚、總黃酮、花色苷的含量變化，以期為紅樹莓果酒產業化生產奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓果實：黑龍江省哈爾濱市售；葡萄酒果酒專用酵母、偏重亞硫酸鉀、皂土（均為食用級）：帝伯仕法國進口；福林-酚試劑（分析純）：天津市光復精細化工研究所；蘆丁標準品（純度99%）、沒食子酸標準品（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

722S可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；WNY-01酒精計：河北省滄州地區醫藥公司；PHS-26數顯pH計：上海精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓果酒的制備工藝流程及操作要點

操作要點：

預處理：挑選新鮮、成熟度高的紅樹莓，去果蒂后漂洗，瀝干。

調整成分：添加白砂糖調節發酵醪濃度至22°Bx，添加碳酸氫鈉溶液調節發酵醪pH值為3.5～4.0。

接種：稱取干酵母溶入10倍質量的白砂糖溶液（2%）中，30℃活化20～30 min，加入1%活化酵母。

主發酵：在23～25℃進行7 d的主發酵，發酵過程中及時進行攪拌，破壞發酵形成的泡蓋，以便完全發酵。

倒罐：當糖度＜50 g/L，酒精度為10%vol～13%vol時，主發酵結束，將經過主發酵后的發酵醪用4層紗布過濾，倒罐裝料率要大，酒液應接近罐頂，以減少罐內氧氣，防止醋酸菌污染。

調整成分：補加白砂糖調節發酵醪濃度至20°Bx。

陳釀：20～22℃左右發酵15 d。

澄清：采用澄清劑法對果酒進行澄清。

殺菌：當產品在輸送鏈上通過殺菌室時，130～160℃的過熱蒸汽從上下噴射45 s。

1.3.2 分析檢測

透光率（T）測定：取澄清后紅樹莓果酒的上清液，以蒸餾水為參比，在波長800 nm處測定透光率；吸光度值（A）測定：因透光率T/%=10-A，所以果酒透光率的變化趨勢與吸光度值的變化趨勢相反，同時測定果酒透光率和吸光度值可規避操作中的人為誤差、環境因素及果酒成分變化對澄清度的影響，更準確的判斷澄清劑濃度、溫度、時間對果酒澄清度的影響。取澄清后紅樹莓果酒的上清液，以蒸餾水為參比，在波長610 nm處測定吸光度值；酒泥高度測定：于25 mL刻度比色管中根據刻度讀取酒泥高度（澄清之后同時測定果酒的透光率、吸光度值、酒泥高度。測定之前不需要澄清處理，經過皂土澄清后的果酒，酒泥結構致密，沉積在瓶底，與酒體上清有明顯分離界限。），酒精度的測定采用酒精計法[13]；殘糖測定斐林試劑滴定法[13]；滴定酸度測定酸堿中和滴定法[13]；花色苷含量測定采用pH示差法[14]；總酚含量測定采用Folin酚法[15]，以沒食子酸標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得到沒食子酸標準曲線回歸方程：y=0.016 0x+0.029 0，相關系數R2=0.999 3；總黃酮含量測定采用比色法[16]，以蘆丁標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得到蘆丁標準曲線回歸方程：y=0.0118x-0.0013，相關系數R2=0.9991。

1.3.3 紅樹莓果酒感官評價

紅樹莓果酒感官評分標準見表1。感官評價請10位品酒專家（男性5名，女性5名），按澄清度（20分）、色澤（20分）、香味（30分）和滋味（30分）的評分標準進行打分，取10位專家打分的平均值作為最終得分，滿分100分。

1.3.4 單因素澄清試驗優化澄清工藝

表1 紅樹莓果酒感官評分標準Table1 Sensory evaluation standards of red raspberry fruit wine

1%皂土溶液的配制：精確稱取1 g皂土，用10 g 50℃的熱蒸餾水充分攪拌均勻，再加蒸餾水89 g，浸泡12～24 h，制成膠體懸浮液，在添加酒液之前再充分攪拌，以便于能夠均勻的分布于酒液中[17]。

皂土添加量的確定：向紅樹莓原酒中添加1%皂土溶液使皂土終含量分別為0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L，在25℃條件下避光隔氧靜置4 d，取上清液測定透光率、吸光度值，并讀取酒泥高度[18]。

皂土澄清時間的確定：固定皂土添加量0.03g/L，在25℃條件下，避光隔氧靜置2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、15 d，取上清液測定透光率、吸光度值，并讀取酒泥高度。

皂土澄清溫度的確定：固定皂土添加量0.03g/L，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃條件下，避光隔氧靜置4d，取上清液測定透光率、吸光度值，并讀取酒泥高度。

1.3.5 響應曲面優化澄清工藝

為分析各個因素之間的交互作用對紅樹莓果酒透光率的影響，在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法，以透光率（Y）為響應值，澄清溫度（X1）、皂土添加量（X2）、澄清時間（X3）為考察因素，通過Design Expert 8.06設計3因素3水平試驗，根據結果進行分析，并驗證結果的可靠性。響應面優化因素與水平設計見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 數據處理與分析

每個試驗均為3次重復，數據采用“平均值±標準差”表示，采用Excel 2010、Origin 8.0、Design-Expert 8.06、SPSS24進行分析處理并作圖。

2 結果與分析

2.1 皂土澄清工藝優化的單因素試驗

2.1.1 皂土添加量對澄清效果的影響

圖1 皂土添加量對紅樹莓果酒澄清效果的影響Fig.1 Effect of bentonite addition on clarification effect of red raspberry fruit wine

由圖1可知，皂土添加量在0.01～0.04 g/L范圍內，吸光度值沒有明顯變化（P＞0.05），果酒的透光率及酒泥高度隨皂土添加量增大而增加；皂土添加量為0.04 g/L時，果酒的透光率及酒泥高度均為最大，分別為95.5%、0.2 cm；皂土添加量＞0.04 g/L之后，透光率及酒泥高度減小?？赡苁怯捎谠硗廖侥芰_到平衡后，增加皂土添加量，因下膠過量而引起酒體渾濁。因此，選擇最佳皂土添加量為0.04g/L。

2.1.2 澄清溫度對澄清效果的影響

圖2 澄清溫度對紅樹莓果酒澄清效果的影響Fig.2 Effect of clarification temperature on clarification effect of red raspberry fruit wine

由圖2可知，澄清溫度在15～45℃范圍內，紅樹莓果酒透光率和酒泥高度隨澄清溫度的增加先增大后減??；澄清溫度在溫度20℃時透光率和酒泥高度均為最大，分別為94.8%、0.36 cm；澄清溫度＞20℃之后，皂土的架橋作用弱于膠體作用，澄清效果下降[19]，透光率和酒泥高度隨澄清溫度的增加逐漸減小。吸光度值隨澄清溫度的增加先減小后增大，并在澄清溫度為20℃達到最小值。在溫度20℃時酒體豐滿，清澈透明，果香濃郁。因此，最佳澄清溫度為20℃。

2.1.3 澄清時間對澄清效果的影響

圖3 澄清時間對紅樹莓果酒澄清效果的影響Fig.3 Effect of clarification time on clarification effect of red raspberry fruit wine

由圖3可知，紅樹莓果酒的透光率隨澄清時間在2～15d范圍內的增加先增大后減小，并在澄清時間6 d時透光率達最大，為94.8%，澄清時間＞6 d之后，透光率逐漸下降。酒泥高度隨時間在2～15 d范圍內的增加而逐漸增大，吸光度值隨時間的延長先減小后增大。澄清6d后的紅樹莓果酒澄清透明，色澤光亮，酒泥致密。因此，最佳澄清時間為6 d。

2.2 皂土澄清工藝的響應面優化

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken設計試驗，設計3因素3水平響應面試驗，以透光率（Y）為響應值，響應面試驗設計及試驗結果見表3。方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 響應面試驗二次回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of quadratic regression equation of response surface experiments

由表4可知，方差分析模型中P＜0.01，說明模型極顯著，擬合精度好，可利用該響應面近似模型進行后續優化；失擬項P＞0.05，視為不顯著，說明該模型在被研究的整個回歸區域內擬合較好；模型決定系數R2=0.899 5，說明相關性較好，模型預測值能較好的反映實際值[20]。因此，回歸方程符合檢驗原則，該模型合適，可以用此分析皂土添加量、澄清溫度、澄清時間對紅樹莓果酒透光率的影響。模擬項的X1、X2、X12達到極顯著水平（P＜0.01），X3、X22、X32對響應值無顯著影響（P＞0.05），結合F值，可以看出各因素對于果酒透光率的影響順序分別為：X1＞X2＞X3。擬合回歸方程為：

以回歸方程為依據，給制各參數間交互作用的三維空間響應曲面圖，考察在皂土添加量、澄清溫度、澄清時間中某一個因素固定為中心值時，其他兩個因素的交互作用對紅樹莓果酒透光率的影響，結果見圖4。由圖4可知，響應面曲面圖可反映各因素間的交互作用對響應值的顯著程度，曲面越陡表示交互作用越強，曲面越平表示交互作用越弱。3個因素之間交互作用的強弱可以通過等高線形狀直觀反映出來，交互作用越明顯，則等高線的橢圓越明顯，反之就越圓。3個因素交互作用X1X2＞X1X3＞X2X3，與表4方差分析結果相符。

圖4 皂土添加量、澄清時間及澄清溫度對紅樹莓果酒澄清效果影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between bentonite addition,clarification time and temperature on clarification effect of red raspberry fruit wine

采用軟件優化功能得出在所選試驗因素范圍，最佳試驗條件為澄清溫度21.27℃、皂土添加量0.04 g/L、澄清時間8 d，模型預測透光率95.60%?？紤]到實際操作，選取最佳澄清條件為皂土添加量0.04 g/L、澄清溫度21℃、澄清時間8 d。在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，澄清后紅樹莓果酒透光率可達96.40%，與預測值非常接近，這表明該模型能較好地預測紅樹莓果酒澄清效果。

2.3 澄清劑處理對紅樹莓果酒理化指標的影響

紅樹莓果酒澄清前后理化指標的對比，結果見表5所示。

表5 紅樹莓果酒澄清前后理化指標對比Table 5 Comparison of physical and chemical indexes before and after clarification of red raspberry fruit wine

由表5可知，澄清度比未處理前提高了39.7%，總糖、滴定酸、酒精度、總酚、總黃酮、花色苷均有所下降。透光率、酒精度、總酚、總黃酮、花色苷澄清前后變化極顯著（P＜0.01），感官評分變化顯著（P＜0.05），總糖、滴定酸變化不顯著（P＞0.05）。

澄清后果酒透光率相比原酒得到提高，花色苷、酚類物質、黃酮類物質的含量相比原酒降低。皂土在澄清過程中吸附酒體中的單寧，單寧的去除可減少果酒的酸澀感，口感醇厚，酸甜適中，果香與酒香協調，酒體呈玫瑰紅色且澄清透亮，因此，相比原酒，澄清后果酒的感官評分明顯提高。澄清后果酒的酒精度雖有下降，但維持在15.8%vol；紅樹莓果酒中的酸有原料帶來的檸檬酸，也有發酵產生的醋酸、乳酸、丁酸、琥珀酸等，若含酸量適當，則果酒滋味醇厚、協調、適口，反之則差；澄清前后果酒中糖分變化不明顯，對果酒口感無太大影響；澄清后果酒中總酚、黃酮、花色苷含量相比原酒雖有減少，但酒體中仍然保留有這些活性成分，并且通過澄清除去了一部分大分子膠體物質，使得果酒清亮透明，有光澤，無懸浮、沉淀和渾濁現象。

3 結論

本研究采用單因素及響應面試驗優化了皂土對紅樹莓果酒的澄清工藝為皂土添加量0.04 g/L，澄清溫度21℃，澄清時間8d。在此優化條件下，紅樹莓果酒透光率為96.40%，總糖含量7.13 g/L，酒精度15.8%vol，滴定酸度20.5 g/L，總酚含量0.83 g/L，總黃酮含量2.29 g/L，花色苷含量0.89 g/L，感官評分88分。澄清后果酒清亮透明，顏色酒紅，酒體豐滿，醇厚協調。