紫外分光光度法檢測豆腐渣中植物雌激素的含量

孫勇　王豐瑋　徐曉燕

[摘要]本研究主要對檢測豆腐渣中植物雌激素含量的方法展開研究，然后通過實驗研究的方式探討紫外分光光度法的具體應用。選取染料木素作為研究的標準品，應用紫外分光光度計對豆腐渣中的植物雌激素含量進行檢測。紫外分光光度法是一種基于物質分子對不同波段光輻射吸收存在著較大差異而建立的方法。通過大量的實踐研究證明，該方法用于物質含量的測定有著較大的優勢，不僅操作較為簡便，而且具有較高的準確度，因此該方法被廣泛應用于保健品的檢驗之中。本研究將該方法應用到豆腐渣中植物雌激素的含量測量上，也同樣取得了較好的效果。

[關鍵詞]植物雌激素；檢測方法；豆腐渣；含量

中圖分類號：TS207.3 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180410

隨著人們生活水平的不斷提高，如何獲得健康越來越成為人們關注的話題。在現在快節奏、壓力大的生活環境下，人們自身的免疫力逐漸下降，癌癥和心腦血管等疾病的發病率逐步提高，更需要營養來維持機能、保護健康，植物雌激素就是一個很好的選擇。

豆科植物在成長過程中會形成一定含量的植物雌激素，該物質屬于豆科植物產生的二級代謝物。從眾多關于該物質的研究中表明，大豆植物雌激素對人體生理有著積極作用，長期食用可有效降低許多疾病的發生率，如婦女更年期綜合征、高血脂、乳腺癌、骨質疏松、前列腺疾病等，同時在抗癌方面也展現出較好的效果。

1植物雌激素的相關性質

1.1植物雌激素的概念

植物中具有弱雌激素作用的化合物是植物雌激素，其弱雌激素效應是經過與甾體雌性激素受體以低親和度結合而發揮的。植物雌激素是一種具有和動物雌性激素生物活性相似的植物成分，它們對激素水平不穩定引起的一系列疾病有著很大的作用力，特別是對防治乳腺疾病、絕經期出現的很多綜合征、前列腺疾病、骨質疏松和心腦血管疾病非常有效。盡管被廣泛稱為植物雌激素，但其實它們本身并不是激素，異黃酮的活性結構和成分，其結構類型與女性體內所需要的雌性激素非常相似，可以起到選擇干擾、選擇模擬、雙向調節內分泌水平的生理作用，給廣大女性遠離煩惱、追求健康帶來了新的曙光。從植物尤其是豆科類植物中提取的植物雌激素可以替代雌激素，并且還可以防止雌激素發生不良反應。

傳統中醫也認為，大豆等植物所具有的營養成分，在臨床上經常用來降血糖、降脂肪、降血壓以及預防心腦血管疾病、動脈粥樣硬化等疾病，這是由于植物雌激素可以保護血管的彈性，降低心腦血管疾病的發生率。長期使用雌激素能針對多種生命器官產生“雌激素樣作用”，產生作用的部位包括女性乳房和卵巢。與藥物雌激素相比，紫花苜蓿、堅果、谷物大豆中的植物雌激素食用起來既方便又安全。

1.2植物雌激素的化學結構

異黃酮、二苯乙烯和木酚素是天然存在于植物中的成分，顯示出一定的雌激素活性，但其生物活性相對較弱，與哺乳動物雌激素17β-雌二醇的結構相似，主要是與雌二醇的特征更為相似，其中包括一對羥基和苯酚環，對雌激素受體吸附后者起著決定性的作用。然而，不同的植物雌激素結構存在的一些細小差異可能會極大地改變雌激素活性。植物雌激素的結構式見圖1。

1.3植物雌激素的特點

1.3.1雙向調節作用

植物雌激素的結構類似物與雌激素活性有關，表現出協同抑制植物雌激素。雙向調節作用是指當人體內雌激素水平過低時，植物雌激素占據雌激素受體，發揮弱雌激素的效應，表現出體內雌激素水平升高；當人體內雌激素水平過高時，植物雌激素受體占據“競爭”的地位，同時發揮弱雌激素效應，因此一般表現出較低的雌激素水平。

1.3.2具有選擇性

和植物雌激素親和力很強的是膀胱、前列腺、心腦血管這些受體，但和卵巢、骨組織、乳房、子宮等的親和力比較弱，其活性僅為雌性激素的1N99～1/999 99。植物雌激素能選擇性地與雌激素結合，減少雌激素誘發癌癥的概率。

1.4不同加工方法對植物雌激素含量的影響

各種豆制品的植物雌激素種類和含量分布是不同的，不僅與種植環境和品種有關，還與加工過程緊密相連。熱處理、水處理、凝固等加工工藝過程和方法對大豆制品中的植物雌激素含量和物種分布也是有影響的，特別是大豆分離蛋白和大豆濃縮蛋白的不同制取方法對植物雌激素含量的影響是最大的。

1.4.1熱處理

植物雌激素遇到過熱的水會增加向外的滲透速度，熱水的滲透使大量的植物雌激素減少，同時大豆制品中的植物物種分布由于熱處理會發生改變，因為酶的活性在熱處理時會不斷升高，把植物雌激素糖苷水解為自由型植物雌激素，所以自由型植物雌激素的比重在大豆制品中會逐漸增加。

1.4.2水處理

浸泡會使植物雌激素的9%丟失在水中，而且經過水處理后的大豆中植物雌激素游離型有所增加。

1.4.3發酵工藝

發酵會改變植物雌激素的物種分布，但并不影響植物雌激素的含量，發酵后產品的主要存在形式是自由型植物雌激素，這是由于在發酵的過程中，水解酶產生的大量菌水解了雌激素糖苷，從而自由型的植物雌激素就會有所增加。

1.4.4凝固工藝

在豆腐渣的凝固過程中，植物雌激素會因為凝固損失于乳清中，損失率為39%。

1.4.5加工提取方法

大豆濃縮蛋白和大豆分離蛋白含量由于提取植物雌激素的方法也會有所影響?？扇苄蕴妓衔锶绻脻駸崴捶ㄏ礈斓玫綕饪s蛋白的植物雌激素含量與原料大豆中的含量非常接近，但是大豆濃縮蛋白的植物雌激素用55%～60%的乙醇溶液洗滌，提取得到的只為原料中的1/9。

1.5植物雌激素的作用

1.5.1改善膚質，緩解更年期不適

植物雌激素的類雌激素樣作用可使人皮膚細膩、潤滑、不松弛且富有彈性；提亮膚色，使黑色素不沉著，膚色均勻；雌激素水平可以得到調節，更年期的癥狀會有所緩解。

1.5.2改善經期紊亂

月經期間不舒服是雌激素分泌不足引起的，植物雌激素的雙向調節作用可以使雌激素水平恢復正常，改善經期不適的情況。

1.5.3延緩衰老

植物雌激素可以推遲更年期的到來，減緩女性卵巢功能衰退的速度。

1.5.4預防心腦血管疾病

植物雌激素可以預防心腦血管疾病，防止動脈粥樣硬化疾病的發生。

1.5.5防治骨質疏松癥

植物雌激素可以維持人體雌激素的分泌水平，及時為人體補充植物雌激素，有效預防骨質疏松。

1.5.6預防乳腺癌

雌激素的雙向調節可減少女性由于雌激素的水平過高而患乳腺癌的概率。

1.5.7改善產后精神障礙

婦女分娩后雌激素水平過低，還未得到恢復，容易形成精神障礙，從而導致植物神經紊亂，及時補充植物雌激素可以有效改善產后精神障礙。

1.6植物雌激素的前景與展望

由于植物雌激素有明顯的生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、保護血管、改善骨質疏、抗炎等，在社會上和學術界開始受到越來越多的重視，成為近年來科學家研究的重點。隨著人民生活水平的不斷提高，健康越來越成為人們重視的問題，大豆植物雌激素具有廣闊的前景。美國首先發現了植物雌激素的生理特點，指出大豆物質中的最具有藥用價值的活性成分就是植物雌激素。1999年許多著名專家對于天然活性物質具有抗癌作用展開了會議，肯定了大豆植物的雌激素是有效的抗癌活性物質，同時指出了植物雌激素具有以下生理特點：（1）是保健品和藥品昂貴的添加劑和配料，可以防治肺癌、結腸癌、前列腺癌和乳腺癌的發生；（2）可以防治與抑制白血病、骨質增生和心血管疾病，具有抗溶血活性和抗真菌活性。因此，在保健食品和醫藥領域植物雌激素將會有廣闊的應用前景。

但是再好的東西也只能適量補充，植物雌激素也有它不利的一面，高劑量的雌激素對生長發育有不利影響，它會改變女性的月經周期。因此，我們應該更加深入地研究，通過進行更多的實驗，使植物雌激素更加科學合理地被開發和被利用。

2豆腐渣的介紹

2.1豆腐渣的來源

豆腐是最常見的豆制品，又稱水豆腐，主要的生產過程是制漿和凝固成形。制漿即將大豆制成豆漿；凝固成形即豆漿在熱量與凝固劑的共同作用下凝固成含有大量水分的凝膠體。豆腐渣是豆腐加工的副產品，是在制豆腐時濾去漿汁后所剩下的渣滓，含有較豐富的營養物質，其粗蛋白含量可達25%～30%，是膳食纖維中最好的纖維素，被稱為“大豆纖維”。

2.2豆腐渣對人的益處

大豆的植物雌激素含量非常高，而作為大豆制品的豆腐渣，其植物雌激素含量也不低。豆腐渣營養非常豐富，含有多種人體不可或缺的鐵、鈣、鎂等微量元素，同時富含優質蛋白、糖和植物油，素有“植物肉”的美譽，對人的益處特別多。

2.2.1消油降脂

含有食物纖維的豆腐渣可以吸附膽固醇，從而防止吸收多余的膽固醇，有效降低血液中膽固醇的含量，防止增加血液黏度，預防動脈粥樣硬化、高血壓、中風等疾病的發生。

2.2.2治療便秘

大量食物纖維存在于豆腐渣中，經常吃豆腐渣能增加糞便的體積，有利于體內毒素的排出，可以促進腸道的蠕動，使大便變軟，有利于排出大便，防止出現便秘等一系列肛腸問題。補益清熱的健康食品第一位當屬豆腐渣，常食用豆腐渣可清熱潤燥、補氣、清理腸胃、生津止渴，熱性體質更適合食用豆腐渣，可用于調理口臭、腸胃不清，有助于患者發熱后的恢復。

2.2.3減肥消脂

豆腐渣的特點是高蛋白質、低熱量、高膳食纖維、低脂肪，人吃過之后能夠增加飽腹感，而且熱量低于其他食物，因此非常適用于減肥人群。

2.2.4降血糖

豆腐渣除了含有膳食纖維，還含有不飽和脂肪酸、粗蛋白，這些物質有助于延緩糖分在腸道的被吸收能力，降低就餐后血糖上升的速度，使糖尿病患者的血糖得到有效的控制。

2.2.5抑制癌癥

豆腐渣中含有抑制癌癥的有效成分如豆甾醇、甾固醇，經常食用豆腐渣，能夠大大降低結腸癌、胰腺癌的發病率。

2.2.6預防骨質疏松癥

醫學家證明，豆腐渣除了有幫助人體消化、增加營養吸收、調節消化不良的功能外，對骨骼、牙齒的生長發育也大有益處，還可以增加造血時血液中的鐵含量。豆腐渣中含有大量的鈣元素，易消化吸收，吸收和消化率高達90%以上，常吃豆腐渣有利于老年人預防骨質疏松癥。

3植物雌激素含量測定的方法

測定植物雌激素含量的方法有很多種，如紫外分光光度法、高效液相色譜串聯質譜法、毛細管電泳法、薄層掃描色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。

3.1紫外分光光度法

紫外分光光度法是基于物質分子對200～400nm光輻射的吸收而建立起來的方法。由于200～400nm光輻射的能量主要適用于物質中原子價電子的能級躍遷，可以導致這些電子的躍遷。該方法簡便、準確、重現性好，適用于保健品的日常分析植物雌激素的含量。

3.2高效液相色譜串聯質譜法

在植物雌激素被高效液相色譜串聯質譜法檢測時，如果色譜圖中每個峰用標準樣品定性方法確定，因為有許多類型的植物雌激素，所以標準樣品的需求各種各樣。植物雌激素標準樣品是特別昂貴的，目前丙二酰和乙酰形式異黃酮標準樣品尚無任何供應廠商，合成標準樣品或自行分離的方法非常麻煩，不提倡使用。若檢測使用植物雌激素水解為苷元，如果水解加入氯離子會使色譜柱的使用壽命大大縮短，從而使用高效液相色譜法定性和定量分析植物雌激素有很多不方便。用高效液相色譜串聯質譜法聯用技術檢測植物雌激素，解決了定性由于缺乏標準樣品的分析問題，能快速準確地確定色譜峰在色譜圖的歸屬。因為丙二酰和乙酰形式異黃酮的異黃酮糖苷和摩爾消光系數相同，根據異黃酮糖苷標準樣品來計算響應因子的含量，所以只需要3種異黃酮糖苷標準品，便可用于定量分析所有的植物雌激素，植物雌激素的定性和定量分析因此也很方便。

3.3毛細管電泳法

毛細管電泳法的優點是采樣高、速度快、分離效率高，處理起樣品來非常經濟簡便，此方法漸漸成為植物雌激素含量的重要測定方法之一。

3.4薄層掃描色譜法

薄層掃描色譜法的優點是分離效果好、取樣量少、操作簡單，但是人為操作誤差大，而且顯色劑薄層用量難以精確控制，定量準確度低，分離效果不高，所以不提倡使用。

3.5氣相色譜法

氣相色譜法的優點是敏感性高、進樣量少、特異性強、選擇性高，但是需制備衍生物來測定金雀異黃素和大豆黃素，制備樣品過程復雜，易受雜質的干擾，價格昂貴且耗時比較久，因此該方法的普及受到了限制。

3.6高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前在植物雌激素的研究最廣泛的測定方法之一，用不同濃度的甲醇、乙醇提取樣品，超聲回流提取直接用酸或酶水解后測定。該方法的特點是分離效率高、樣品的測定方法廣、樣品制備過程簡單、成本低廉、靈敏度高、測量結果的準確性好等，有多樣選擇的檢測器。該方法和紫外分光光度法一樣也適用于保健品的日常分析和質量控制，但高效液相色譜法測試時間太長，運行成本又過高，特別是豆腐渣中植物雌激素的含量需要被反復檢查、探索和提取，不利于大規模生產和操作。

此外，在醫學上對植物雌激素的含量進行測定還有酶聯免疫吸附法和時間分辨熒光免疫法，這些方法在對植物雌激素的測定方面可以達到一個很好的效果，其他方便快速的分析方法需要更進一步的研究和使用。

通過以上對比，本研究采用紫外分光光度法分析測定豆腐渣中植物雌激素含量。

4實驗部分

4.1實驗儀器與試劑

4.1.1儀器

紫外可見分光光度計、超聲波清洗機、電熱恒溫水浴鍋、旋轉蒸發器、電子分析天平、冷卻裝置、粉碎機、烘箱、10目標準篩。

4.1.2試劑

新鮮豆腐渣（現場制作）、石油醚（沸程55℃～85℃）、染料木素標準品、95%乙醇溶液。

4.2實驗方法

4.2.1標準溶液的配制

準確稱取染料木素標準品1.29mg，置于10mL容量瓶中，以95%乙醇稀釋攪拌至溶解，并用蒸餾水定容至刻度，搖勻靜置，濃度為129mg/L。

4.2.2樣品溶液的制備

現場制作的豆腐渣在55℃鼓風機條件下鼓風干燥72h平行至恒重，過10目篩，用石油醚脫脂48h，去除其濾液，烘干濾渣，采用超聲波法提取豆腐渣中植物雌激素。稱取已處理豆腐渣粉4.5g，溶于35mL80%的乙醇溶液中，超聲波提取的溫度為55℃，提取時間為0.5h，然后將其提取液過濾，置于50mL容量瓶中，用95%乙醇溶液定容至刻度靜置。

4.2.3波長的選擇

分別取適量配置好的標準溶液和樣品溶液，用95%乙醇溶液稀釋至合適的濃度，用95%乙醇溶液做空白試驗，在紫外區波長為200～400nm進行掃描，采樣的間隔為1nm，勻速采樣，根據紫外吸收光譜圖確定樣品的測定波長。染料木素標準溶液在不同波長時的吸光度見表1，豆腐渣待測樣品液在不同波長時的吸光度見表2。

4.2.4標準曲線的繪制

準確吸取0.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL的標準溶液分別置于10mL的容量瓶中，各加2.0mL的95%乙醇溶液，再加蒸餾水定容至刻度，搖勻靜置。用2.0mL的95%乙醇溶液加蒸餾水定容至10mL的溶液做空白試驗，在260nm處測量溶液的吸光度，重復3次，測定結果取其平均值。染料木素標準溶液紫外吸收光譜見圖2。

4.2.5豆腐渣樣品中植物雌激素的測定

準確移取1.0mL待測樣品溶液，置于10mL的容量瓶中，加2.0mL的95%乙醇，蒸餾水定容至刻度。在260nto處測量定容后溶液的吸光度，重復3次，測定結果取平均值。根據標準曲線的回歸方程，計算出植物雌激素的含量。豆腐渣待測樣品液紫外吸收光譜見圖3。

4.3結果與分析

4.3.1檢測波長的確定

從200～400nm掃描的紫外吸收光譜圖可以看出，染料木素標準品溶液在260nm處有最大紫外吸收峰，樣品液在258nm處有最大紫外吸收峰，二者的最大紫外吸收波長大體一致。由于定量分析建立在染料木素標準品溶液的基礎上，故取260nm作為紫外檢測波長。

4.3.2標準曲線的繪制

以染料木素濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖4。用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為C=8.063 4A-0.052 9，R²=0.999 3。

4.3.3精密度試驗

精密吸取0.5mL標準溶液于10mL容量瓶中，加入1.0mL的95%乙醇溶液，蒸餾水定容至刻度搖勻靜置。分別取6份定容后的溶液加至石英比色皿中的3/5處，連續在260nm處測量其吸光度，計算吸光度的相對標準偏差和標準偏差。以吸光度為縱坐標，測定次數為橫坐標繪制曲線，標準曲線見圖5。在線性范圍內，6次測量結果的平均吸光度為0.807 9，標準偏差為0.002 1，相對標準偏差為0.27%。由于上述誤差在可以接受的范圍內，說明試驗的重現性較好，紫外分光光度法測定豆腐渣提取物中植物雌激素具有良好的精密度。

4.3.4重復性試驗

精密吸取0.5mL樣品溶液6份，置于6個10mL容量瓶中，各加1.0mL的95%乙醇溶液，蒸餾水定容至刻度并搖勻靜置。在260nm處測量其吸光度，以吸光度為縱坐標，測定次數為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖6。計算相對標準偏差。在線性范圍內，6次測量的平均吸光度為0.962 6，標準偏差為0.003 4，相對標準偏差0.35%，試驗的重現性較好。

4.3.5穩定性試驗

精密吸取0.5mL新鮮配制的標準溶液和待測樣品溶液各6份，置于12個10mL容量瓶中，各加1.0mL的95%乙醇，蒸餾水定容至刻度。分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h在260nm處測量溶液的吸光度，確定其穩定性結果，以吸光度為縱坐標，測定次數為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線見圖7。標準溶液6次測量結果的平均吸光度為0.802 2，標準偏差為0.007 6，相對標準偏差為0.95%；樣品溶液6次測量結果的平均吸光度為0.962 1，標準偏差為0.002 8，相對標準偏差為0.29%；表明標準溶液和樣品溶液在24h之內是穩定的，所以24h之內測定提取液的吸光度是可行的。

4.3.6加樣回收率試驗

精密吸取O.1mL、0.3mL、0.5mL、0.7mL、0.9mL標準品溶液，分別置于10mL容量瓶中，各加1.0mL的95%乙醇溶液，再分別加入1.0mL樣品溶液，蒸餾水定容至刻度搖勻靜置。將配好的5份溶液分別在260nm下測量吸光度，計算回收率，加樣回收率的測定結果見表3?；厥章势骄禐?00.23%，相對標準偏差為0.85%，表明此方法的回收率良好。

4.4實驗結果

本研究建立了一種采用紫外分光光度測定豆腐渣中植物雌激素含量的方法。以染料木素為標準品，在其最大吸收峰260nm處測定豆腐渣中植物雌激素的含量，得回歸方程為C=8.063 4A-0.052 9，R²=0.999 3，線性范圍1.32～11.80μg/mL，平均回收率達100.23%，相對標準偏差為0.85%。

5結論

5.1紫外分光光度法的主要特點

5.1.1靈敏度高、選擇性好

由于分光光度法的入射光以棱鏡或光柵為單色器，同時在狹縫的控制配合下可得一條譜帶很窄的單色光，因此其測定的靈敏度、選擇性和準確度均比比色法高。紫外分光光度法可測定微量標準物質，測定靈敏度可達1～10μg/m，光度計定量測定的精密度可達0.5%，甚至可以更低。

5.1.2不需要樣品分離裝置

由于分光光度法使用的是純度較高的單色光，因此利用此方法測定含有兩種或兩種以上樣品組分時，不必先進行樣品分離處理，只需選用樣品組分特征波長的單色光就可進行測定分析。

5.1.3有多種定量方法

分光光度法不僅可采用線性回歸方式進行定量，而且可直接通過百分消光系數與摩爾消光系數換算公式進行定量，因而在定量方式上較比色法更具有實效性。

5.2植物雌激素相關研究

中國食品和藥物監測局已公開確認長期食用大豆產品對心血管系統具有保護作用，引起了學術界對植物雌激素的廣泛關注。但仍有許多問題需要解決，如不同植物雌激素的生物活性化合物的差異。在研究人類健康和植物雌激素的關系時，細胞分子水平與大規模的流行病學調查結果的預防和治療作用是不一致的，植物雌激素實驗劑量往往比食物中植物雌激素的含量要多得多，并且使用純度、劑量、類別和其他實驗條件都均不相同，評價的標準缺乏一致性，對研究工作和植物雌激素的廣泛應用增加了一定的難度。但是，隨著植物雌激素在維持人體健康中發揮著越來越明顯的作用，并具有其他很多雌激素不可替代的許多好處，植物雌激素的應用將會越來越廣泛。

任何事物都有兩面性，植物雌激素也不例外。雖然豆制品一般被認為是抑制癌癥、降低有害膽固醇的好東西，從大豆中提取的植物雌激素也被廣泛用于治療女性更年期綜合征，但是最近有科研小組發現，在一些情況下，豆制品也是有害的，甚至還有可能致癌。實驗顯示，體細胞有絲分裂過程由于植物雌激素受到了嚴重影響，這表明大豆植物雌激素及其消化和分解物質存在致癌的風險，還需要通過動物實驗進一步證明其是否會嚴重影響身體的組織和器官，專家建議消費者應適當服用含有濃縮植物雌激素的藥物。