不同貯藏條件下大黃魚生物胺變化

朱作藝，張 玉王君虹李 雪王 偉，*

(1.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 320021；2.農業農村部創意農業重點實驗室，浙江 杭州 310021)

生物胺(biogenic amine，BA)是一類具有生物活性含氮的低分子量有機化合物[1]。過量生物胺會產生諸多不良反應，包括偏頭痛、惡心、血壓變化等，嚴重時導致休克而危及生命[2-4]。生物胺中毒性最大的是組胺，其次是酪胺[5-6]。研究表明：口服8～40 mg組胺導致輕微中毒，40～100 mg引起中度中毒，超過100 mg導致嚴重中毒，酪胺超過100 mg會引起偏頭痛，苯乙胺超過3 mg則導致血壓升高。此外，生物胺容易與亞硝酸鹽反應生成致癌性物質亞硝胺[7]。目前已報道的生物胺產生途徑主要是氨基酸脫羧和醛酮類化合物的氨基化作用[8-9]。生物胺廣泛存在于水產品、肉類產品與發酵制品中[10-16]。歐盟、美國和我國對水產品中的生物胺均有相應的限量要求。

大黃魚屬于低組胺魚類，是我國重要經濟魚類。目前，大黃魚貯藏過程中的品質變化主要研究pH值、揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)值、菌落總數、過氧化值、K值、感官評價等指標，針對其生物胺變化規律及與品質之間相關性的研究尚未見報道。目前，生物胺的測定方法主要有薄層色譜法[17]、氣相色譜法[18]、離子色譜法[19]、液相色譜法[20-21]等。本研究采用離子色譜法測定生物胺，研究了不同溫度(0、4、25 ℃)和不同鹽分(0、0.5%、2.0%、5.0% NaCl)處理條件下大黃魚中生物胺與貯藏時間的關系，并通過分析生物胺與腐敗指標(TVB-N值)的相關性，研究生物胺與大黃魚品質的關系，以期為控制大黃魚生物胺生成、提高大黃魚貯藏質量、保障其食用安全提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大黃魚購于杭州沃爾瑪超市，產自福建寧德，屬養殖品種，已于-18 ℃條件下凍結6 d，直接從冷庫(-18 ℃)挑選個體均一(每條約400 g)、背部灰褐色、腹部金黃色的個體，冰藏條件下2 h內運回實驗室。

Dionex ICS-3000離子色譜儀(Thermofisher)，配有DP雙泵(帶脫氣裝置)，DS6電導檢測器，Chromeleon 6.8色譜工作站(用于軟件控制及數據采集)；Ultimate 3000系列VWD-3X00 UV-VIS檢測器(Thermofisher)；AS自動進樣器(Thermofisher)；Dionex IonPac CG17(50 mm×4 mm)保護柱，Dionex IonPac CS17(250 mm×4 mm)分析柱；Dionex CSRS 300-4 mm電化學自再生抑制器；超純水系統；渦旋混勻器；離心機；0.22 μm尼龍濾膜過濾頭。

99%甲基磺酸(MSA)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；乙腈(色譜純)，Merck公司；其他化學試劑均為分析純，所有用水均為電阻率≥18.2 MΩ·cm去離子水。

標準品：組胺(histamine，His)，酪胺(tyramine，Tyr)，腐胺(putrescine， Put)，尸胺(cadaverine，Cad)，苯乙胺(phenylethylamine，Phe)，亞精胺(spermidine，Spd)，精胺(spermine，Spe)，均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 樣品制備

將大黃魚破腹，去內臟、去頭、去鱗、去皮，清洗干凈，采用縱向剖片方式取大黃魚肉片，瀝干后裝入聚乙烯自封袋中。取部分大黃魚肉片，分成3組，分別于0、4、25 ℃下貯藏，0、4 ℃貯藏16 d，25 ℃貯藏6 d。另取部分大黃魚肉片，分成3組，根據肉片質量稱取一定量的NaCl(分別占肉片質量的0.5%、2.0%、5.0%)，涂抹于肉片表面，于25 ℃貯藏6 d。

1.3 生物胺測定方法

1.3.1 標準儲備液和標準工作液的配制

分別準確稱取50 mg上述7種生物胺標準品，置于50 mL容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻后分別得到濃度為1 000 mg·L-1的各種生物胺標準儲備液，將儲備液于4 ℃避光保存。分別吸取上述標準儲備液，用10 mmol·L-1的MSA溶液稀釋，配制不同濃度的生物胺混合標準工作溶液，用于制作標準曲線，對大黃魚樣品中生物胺進行定量。

1.3.2 淋洗液配制

配制0.1 mol·L-1MSA溶液(用于梯度淋洗脫)：吸取6.5 mL的99% MSA，用去離子水定容至1 L，采用0.45 μm微孔水膜過濾，超聲脫氣15 min。

1.3.3 色譜條件

陽離子交換色譜柱：Dionex Ionpac CG17保護柱(50 mm×4 mm)+Dionex Ionpac CS17分析柱(250 mm×4 mm)。流動相：0～12 min， 10 mmol·L-1MSA；12～25 min，10～35 mmol·L-1MSA；25～30 min，10 mmol·L-1MSA。流速：1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃。自再生電化學抑制模式，抑制器設置電流103 mA。檢測方式：抑制電導與紫外串聯檢測；電導檢測池溫度：35 ℃；紫外檢測波長：276 nm(用于檢測酪胺)；進樣量：25 μL。外標法峰面積定量。

1.3.4 樣品前處理

大黃魚肉片樣品在勻漿機上徹底粉碎勻漿，取5.0 g待測樣品加入50 mL的10 mmol·L-1MSA，超聲提取30 min，冷凍離心機(4 ℃，8 500g)離心10 min，取上清液5 mL，加5 mL乙腈渦旋混勻，離心后取上層液體4 mL用去離子水稀釋至10 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，然后進樣上機。

1.4 揮發性鹽基氮的測定

不同溫度、鹽分貯藏條件下大黃魚的TVB-N值參照GB/T 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的第二法——自動凱氏定氮法進行測定。

2 結果與分析

2.1 生物胺的色譜分離檢測

本研究建立陽離子交換色譜分離-抑制型電導-紫外串聯檢測腐胺、尸胺、組胺、亞精胺、苯乙胺、精胺、酪胺7種生物胺的方法。由于酪胺經抑制后無電導信號，但酪胺具有較強的紫外吸收，因此酪胺采用紫外檢測，其他生物胺采用抑制電導檢測。通過陽離子交換色譜柱進行分離，采用甲基磺酸溶液作為淋洗液進行梯度洗脫。結果表明，7種生物胺能達到較好的分離效果(圖1)。7種生物胺在0.1～100 mg·L-1內線性關系良好，線性相關系數均大于0.999 0，方法檢出限介于0.35～1.76 mg·kg-1，樣品加標回收率均介于88.2%～108.8%，方法精密度(RSD)小于4.1%(n=6)，表明該方法簡單、方便，具有較好的重現性和準確性，適用于大黃魚中生物胺的測定。

2.2 不同貯藏溫度下大黃魚中生物胺的含量

溫度對大黃魚肌肉組織中生物胺的產生有重要影響，溫度越高，生物胺產生速度越快。從表1可知，大黃魚在0、4 ℃貯藏16 d，生物胺總量的變化范圍分別為1.41～17.53、1.53～187.63 mg·kg-1，在25 ℃僅貯藏6 d，生物胺總量的變化范圍為9.44～2 539.22 mg·kg-1。大黃魚整個貯藏過程中均未檢出His和Spe，而Spd本身存在于肌肉組織中，全程均有檢出，其含量隨著貯藏時間出現小幅波動變化。0 ℃貯藏條件下，1～16 d，Put和Spd均有檢出，Tyr在第10天開始檢出，整體呈緩慢增加的趨勢。4 ℃貯藏條件下，除Cad和Tyr均從第6天開始有檢出、Put和Tyr在貯藏后期增加趨勢更為明顯外，其他變化情況與0 ℃貯藏條件下相似。25 ℃貯藏條件下，Put、Cad和Tyr隨著貯藏時間的延長急劇增加，生物胺總量在第2 天就由9.44 mg·kg-1迅速升高至306.26 mg·kg-1左右。由此說明，溫度越高，生物胺產生越快。在整個貯藏過程中，Cad的變化尤其顯著，Spd在整個貯藏期間變化不顯著，始終保持在較低水平。貯藏第4天開始有Phe檢出，在4～6 d為5.03～85.20 mg·kg-1。鑒于大黃魚中生物胺含量較高且變化明顯的為Put、Cad和Tyr，因此，這3種生物胺可作為評價大黃魚鮮度品質的特征生物胺。Kanki等[22]認為，生物胺產生菌有嗜冷菌和嗜溫菌2大類，魚體在不同溫度時帶的菌不同，不僅高溫時產生生物胺，低溫時也能產生生物胺，只不過低溫時菌體代謝緩慢，生物胺的產量低。

TVB-N是新鮮肉組織受到外界微生物感染，由于微生物生長引起的脫羧、脫氨作用導致蛋白質分解而形成的產物，是水產品的一種特定腐敗指標。由圖2可知，不同溫度貯藏條件下大黃魚中的生物胺總含量與TVB-N值變化趨勢整體一致，均隨著貯藏時間的延長呈現上升的趨勢。0 ℃條件下生物胺總量和TVB-N值緩慢上升；4 ℃條件下的生物胺總量和TVB-N值隨著時間延長增加，明顯高于0 ℃；25 ℃條件下的生物胺總量和TVB-N值隨著時間的延長急劇增加，顯著高于0 ℃和4 ℃，表明高溫大大加快了大黃魚的腐敗速度。大黃魚中生物胺在不同溫度貯藏條件下與腐敗指標TVB-N值變化趨勢一致，由此表明，生物胺可以作為評價大黃魚腐敗程度的一種指標。

表1不同貯藏溫度下大黃魚中生物胺含量

Table 1 Content of seven BAs in large yellow croaker stored at different temperature mg·kg-1

“—”表示未檢出。

—， Below detection limit.

圖2 大黃魚生物胺總量(A)與TVB-N(B)在不同貯藏溫度下的變化情況Fig.2 Changes of total BAs (A) and TVB-N (B) in large yellow croaker stored at different temperature

2.3 不同鹽分貯藏條件下大黃魚中生物胺含量

將不同量的NaCl涂在魚肉表面，于25 ℃貯藏，其生物胺含量見表2。不同鹽分條件下整個貯藏過程中均未檢出His和Spe，Spd含量變化范圍較小(0.76～7.92 mg·kg-1)。Put、Cad和Tyr均隨著貯藏時間延長而增加，Phe則在貯藏第4或5天出現。與空白對照組(不添加NaCl)相比，其他含量鹽分貯藏條件下的生物胺均出現不同程度的下降，表明NaCl對大黃魚中生物胺的生成有明顯的抑制作用，而且鹽濃度越高，對生物胺的抑制效果越好。大黃魚在0、0.5%、2.0%和5.0% NaCl條件下貯藏6 d，其生物胺總量變化范圍分別為9.44～2 539.22、2.82～2 050.34、4.60～1 305.95、1.32～120.93 mg·kg-1。NaCl對Put、Cad和Tyr有相似的抑制效果，但對Spd影響不大。與空白對照組相比，NaCl含量為0.5%時，各生物胺含量略微有些下降，但效果不明顯；NaCl含量為2.0%時，3種特征生物胺含量相對空白對照下降50%左右；NaCl含量為5.0%時，Put、Cad、Tyr含量急劇下降，第6天時，Cad和Tyr含量分別為30.80、5.39 mg·kg-1，而此時空白對照組Cad和Tyr含量分別為1 533.50、469.80 mg·kg-1，同時Tyr的檢出時間也逐漸延后，5.0% NaCl貯藏條件下直到第5天才有檢出。Phe均在第4天后才有檢出，隨著NaCl含量的升高，Phe含量有所下降，當NaCl含量達5.0%時，大黃魚肌肉中未檢測到Phe。

表2不同鹽分貯藏條件下大黃魚中生物胺含量

Table 2 Content of seven BAs in large yellow croaker stored with different NaCl concentration mg·kg-1

由圖3可知，不同鹽分貯藏條件下大黃魚中的生物胺總含量與TVB-N值變化趨勢相似，均隨著貯藏時間的延長呈現上升的趨勢，隨著NaCl含量升高，生物胺總量和TVB-N值不斷下降，下降速度也隨著鹽濃度的增加而增大。當NaCl含量達5.0%時，生物胺總含量與TVB-N值抑制效果最明顯，生物胺總量變化范圍為1.32～120.93 mg·kg-1，TVB-N值變化范圍為12.90～51.50 mg·100 mg-1。大黃魚中生物胺在不同鹽分貯藏條件下與腐敗指標TVB-N值變化趨勢一致，表明適當添加一定量的食鹽進行貯藏可作為大黃魚保鮮方法的一種選擇。

圖3 大黃魚生物胺總量(A)與TVB-N(B)在不同鹽分貯藏條件下的變化情況Fig.3 Changes of total BAs (A) and TVB-N (B) in large yellow croaker stored with different NaCl concentrations

3 結論

本實驗研究了不同貯藏條件下大黃魚中生物胺的變化情況，包括0、4 ℃貯藏16 d、25 ℃貯藏6 d，以及不同鹽分(0、0.5%、2.0%、5.0% NaCl)于25 ℃貯藏6 d，大黃魚肌肉組織中7種生物胺含量和相對應的腐敗指標TVB-N值的變化情況。25 ℃條件下，大黃魚肌肉中生物胺和TVB-N值明顯高于0、4 ℃貯藏，特征生物胺Cad、Put和Tyr含量顯著增加，并隨著貯藏時間延長含量遠大于其他生物胺，Phe含量在貯藏后期升高較快，Spd含量基本保持穩定。通過添加不同含量NaCl進行貯藏，在25 ℃條件下，Cad、Put、Phe和Tyr含量均顯著降低，其降低速度隨NaCl含量升高而增加，當NaCl含量達5.0%時，大黃魚中生物胺和TVB-N值均明顯低于其他貯藏組，生物胺抑制效果顯著。綜上，高溫導致生物胺的急劇累積和TVB-N值的急劇增加，大黃魚新鮮度顯著降低，極易腐敗，低溫及適當添加食鹽是控制生物胺產生的有效措施，有利于大黃魚的貯藏保鮮。