厚樸莖段的組織培養

金麗麗，張麗萍

(1.遼寧林業職業技術學院，沈陽 110101；2.遼寧省森林經營研究所，遼寧 丹東 118300)

厚樸為木蘭屬觀花喬木，其組織培養處于初步探索階段。劉賢旺等以凹葉厚樸(Magnoliaofficinalisvar.pubescens)為材料進行了組織培養，最適培養基為VB5+2,4-D 2mg/L+6-BA 1mg/L；其生長的最適培養基為VB5+2,4-D 1mg/L+6-BA 1.5mg/L。雖然植物的組織培養越來越受到眾多科學工作者的重視，但關于厚樸組培苗的獲得只停留在試驗階段，而真正用于生產的實用技術還非常少。本試驗以厚樸莖段為材料進行了組織培養特性研究，試圖找出適合該品種組培快繁的方法。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

厚樸當年生枝條。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的選取與消毒。取當年生、生長健壯的枝條，剪去葉，切成1.0～1.5cm小段，每段至少含1個腋芽。先將切割好的植物材料在自來水龍頭下流水沖洗30min，然后再在洗滌劑溶液中浸泡5min后，用紗布扎住燒杯口(防止植物材料被沖出)，倒掉洗滌劑溶液，自來水龍頭下流水沖洗35min。清洗后在超凈工作臺上進行表面滅菌，用0.1%的升汞(HgCl2)溶液小燒杯中浸泡15min，無菌水沖洗8次。

1.2.2 基本培養基篩選。將滅菌后的莖段放到滅菌濾紙上，并將其頂端和底部切掉約0.5cm(滅菌劑殺死的部分)后，再將剩余莖段切成1cm左右的小莖段，保證每個小莖段至少帶有1個腋芽，插入誘導培養基上，每個培養瓶內接種一個培養物。

將無菌的莖段接到不添加任何植物生長調節劑的空白基本培養基中，供篩選的基本培養基有MS,1/2MS,改良MS。配制基本培養基，白糖3%，瓊脂0.7%，光照14～16h，光照強度2000～2500 lx,溫度22±2℃，pH5.8。每種處理20瓶，重復3次，60d統計生長情況。

1.2.3 初代培養基篩選。以基本培養基、BA、IBA、GA3三個因素三個水平進行試驗，每瓶1株，重復3次，60d培養后及發芽數、發芽率，篩選出最優組合。

1.2.4 繼代培養。厚樸經過無菌體系和初代培養后，打開盛有初代培養基的培養瓶，瓶口過火1次，用過火、冷卻的鑷子夾住分割的莖段并迅速轉接在繼代培養基瓶中，每瓶轉接5～6個莖段，接完后瓶口過火封口。

1.2.5 生根培養。芽叢縱向切成單株，高度在1cm長以上的芽苗可進行生根培養(不足1cm的芽苗及愈傷組織用于繼代培養)，以1/2MS為基本培養基，添加不同濃度的生長調節劑NAA，每個處理接種20瓶，重復3次，30d統計各處理的生根率和生根數。

2 結果與分析

2.1 基本培養基篩選

莖段接種60d，3種培養基在一定程度能夠促進無菌莖段的生長，其中MS效果最不明顯，MS培養基中的莖段無明顯變化，1/2MS培養基葉片伸展，莖節伸長,萌生苗健壯，改良MS培養基培養的莖段葉片伸展，細長，易倒。綜合考慮，選擇1/2MS基本培養較為合適。

2.2 植物生長調節劑種類的篩選

以1/2MS作為初代培養基的基本培養基，添加不同濃度的激素組合，篩選出適合外植體生長的激素種類。試驗結果見表1。

表1 植物生長調節劑對生長的影響

從表1中可以看出，添加6-BA，NAA，IBA都能在一定稱度上促進莖段萌生苗的生長，葉片顏色正常，但添加GA3沒有新葉長出，在一定稱度上抑制萌生苗的生長。因此初步選擇6-BA，NAA，IBA，其中6-BA分裂素和生長素NAA，IBA組合，經過觀察萌生苗的生長狀態，表明6-BA和NAA組合更有利于腋芽的萌發和健壯的生長。

2.3 初代培養基篩選

從表2中可以看出，接種90天后，外植體在各種激素配比中的生長情況有一定差別。培養基中添加6-BA時，外植體的平均萌動率隨NAA濃度的增大而明顯下降，NAA濃度為1.0mg/L時，外植體平均萌動率最低，為25%，萌動較慢，無葉片展開，最后出現褐化、死亡現象。NAA濃度為0.2mg/L時，外植體基部產生白色愈傷組織，接種90d一直保持愈傷組織狀態，直至外植體枯死。NAA濃度為0.5mg/L時，外植體生長明顯，保持萌動狀態，莖尖分化較好，每一個葉腋都有腋芽長出，且沒有愈傷組織。

表2 不同培養基對萌發率的影響

綜合考慮以上情況，外植體在BA 1mg/L和 NAA 0.5mg/L的組合中生長最好。

2.4 繼代培養

將離體初代培養獲得的厚樸無菌苗，剪刀和鑷子灼燒滅菌后，左手水平持種苗瓶，右手持鑷子，使種苗瓶瓶口與右手所持的鑷子在同一水平線上，將芽叢從瓶中取出，放在無菌濾紙上，用手術刀和鑷子配合對芽叢進行分割，并把每個小枝條切割成1～1.5cm的莖段，每個莖段上至少應帶有1個腋芽。轉入繼代誘導的培養基BA 1mg/L和NAA 0.5mg/L中，能夠獲得腋芽發生型叢生苗。

2.5 生根培養

以1/2MS為基本培養基，分別添加不同濃度生長素，結果見表3。

表3 不同NAA濃度對試管苗的影響

NAA是植物組織培養中廣泛應用于誘導不定根的生長素，且植物生長調節劑的濃度也起著決定性作用，結果表明，1.0mg/L對厚樸誘導試管苗生根有促進作用，生根率達65%，生根數為8，葉色濃綠，長勢好。

3 小結

本試驗采用厚樸莖段為初始外植體，將離體的植物材料經過表面滅菌接種在各種培養基中，建立起無菌體系，從而縮短了萌芽時間。1/2MS培養基中無機鹽質量比例適中，能滿足植物的生長。添加過高或過低的NAA濃度對厚樸的組織培養中都有抑制作用。適宜初代、繼代培養基為1/2MS，附加BA 1.0mg/L和 NAA 0.5mg/L，生根培養基1/2MS+NAA 1.0mg/L進行培養。

厚樸在外植體的誘導培養基中使用1/2MS基本培養基生長良好。MS和改良培養基，其無機鹽與離子濃度較高，尤其硝酸鹽濃度較高，含有硝態氮，無銨態氮，和碘化鉀，直接影響細胞生理生化活動，對離子通道也有調控作用，影響各種無機鹽的吸收。1/2MS培養基好于MS培養基，主要是由于無機鹽濃度降低，增進了植物體整體的協調發展，對低濃度硝態氮吸收要好于銨態氮的緣故。

生長素的作用主要是促進細胞伸長和細胞分裂，誘導受傷的組織表面一至數層細胞恢復分裂能力，形成愈傷組織，促進生根等。細胞分裂素有誘導芽的分化、促進側芽萌發生長的作用。試驗只是對厚樸的一個品種進行的研究，誘導培養基中細胞分裂素和生長素濃度的比例保持在2∶1，誘導效果較好。在某些方面和他人也有一定的差異[3]，這可能與其基因型差異和激素濃度有關，還須進一步研究。