兒童重癥監護室侵襲性真菌感染的特點及血漿1，3-B-D葡聚糖檢測的臨床價值

張 渝，朱小石，李運璧，陽 倩

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院兒科，四川 成都 610072)

侵襲性真菌(IFI)感染人體的方式是通過侵入人體內部，在人體的組織器官以及血液中進行生長繁殖，從而使組織受到損傷，并且引發炎癥反應等多種疾病，這其中包括人體深部組織感染以及真菌性敗血癥。深部真菌感染已經成為兒童及新生兒重癥監護室院內感染的常見原因，病死率和并發癥率極高，出生體重<1500克的早產兒病死率高達34%，在年長兒中的病死率也高達16%～28%。常見致病真菌有15種，致侵襲性真菌感染最常見的有5種，分別是白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌和克魯斯酵母菌[1～3]。其初始臨床表現較隱匿，缺乏特異性，容易延誤診斷及治療。傳統的真菌培養以及鑒定需要耗費大量的時間，并且這種方法培養的真菌陽性率很低。1，3-β-D葡聚糖屬于真菌細胞壁中的主要組成成分，在真菌感染初始階段，其在血漿中水平會有一個明顯升高的趨勢，這對于侵襲性真菌感染的臨床診斷有很大的幫助[4]。1，3-β-D葡聚糖檢測(G實驗)已經作為有臨床診斷意義的微生物學證據之一納入兒童侵襲性肺部真菌感染診治指南(2009版)[5]。本研究回顧性分析我院PICU侵襲性真菌感染在臨床上表現的特點，然后對侵襲性真菌感染患兒血漿中1，3-β-D葡聚糖含量進行測定，接著在抗真菌治療期間動態檢測血漿1，3 -β-D葡聚糖變化，探討其對侵襲性真菌感染的早期診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2012年1月至2018年1月本院PICU科收治的所有行G實驗檢查的IFI患兒。IFI 診斷標準按照中國侵襲性真菌感染工作組對侵襲性真菌感染的定義和分類進行判斷[6]。①確診：通過組織病理學可以檢測組織內部的真菌，然后通過無菌組織來培養上述發現的真菌；②臨床診斷：通過研究IFI的宿主以及環境因素，對真菌的臨床以及影像學表現進行研究，并且根據1項微生物學標準進行對比；③擬診：研究得出該真菌中存在IFI宿主以及環境的原因，其次，也有臨床以及影像學表現，或者采用1項微生物學標準來進行衡量。按照IFI的診斷標準分為IFI組和非IFI組，IFI組包括了確診、臨床診斷以及擬診IFI三個方面。并且，將G實驗真陽性為確診和臨床診斷組，排除擬診組。所有IFI組患兒均接受正規抗真菌治療，并于治療7天后復查G實驗。

1.2方法根據GKT-5 M真菌1，3-β-D葡聚糖檢測試劑盒中(北京金山川科技發展公司)說明書的具體實驗步驟操作，采用肝素鈉抗凝的采血管來量取靜脈血2 ml，然后在轉速為3000 r/min的環境下進行離心操作，時間持續60秒，就可以得到含有較多血小板的血漿，然后量取0.1 ml的血漿在其中加入0.9 ml的樣品處理液，將其混合均勻，在70 ℃的環境下進行保溫，時間持續10分鐘，然后將其取出，并且馬上放在冰水中進行水浴，得到的液體就是待測血漿樣品。將上述液體量取0.2 ml，在其直接加入到酶反應的主體之中，等到其完全溶解以后，將溶液加入到微量加樣器之中，并且加入到10 mm ×75 mm標準玻璃反應管之中，將MB-80微生物動態快速檢測系統插入，讓其開始反應，等到反應結束之后，就可以使儀器自動計算，如此就可以知道血漿中1，3-β-D葡聚糖水平如何，正常值<10 pg/ml。觀察PICU患兒發生侵襲性真菌感染的臨床特點，包括廣譜抗生素是否應用，是否有持續長時間的機械通氣，皮質激素是否使用，中心靜脈插管的時間長短以及全胃腸外營養(TPN)的時間有多久。

1.3統計學方法使用SPSS 19.0軟件來對數據進行分析。計數資料以均數±標準差表示，組間比較采用配對t檢驗或t’檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。對于G實驗得到的結果，即可以畫出受試者特征工作曲線(ROC曲線)，計算出曲線下面積。

2 結果

2.1PICU患兒IFI的總體分布特點本組有G實驗結果的患兒共169例，原發病及合并癥：膿毒癥、重癥肺炎、呼吸衰竭、支氣管肺發育不良(糾正胎齡大于40周由新生兒監護室轉入PICU)、低血糖、電解質紊亂、肺動脈高壓(PH)、顱內出血、先天性心臟病、膈疝術后。根據上述標準診斷為IFI的患兒36例，其中確診9例，臨床診斷15例，擬診12例，排除IFI 133例。IFI發生率為1.45%。全部IFI組病例均行中心靜脈置管(PICC 28例，CVC置管8例)，均在診斷IFI前接受過>7天廣譜抗生素治療(頭孢三代或碳青霉烯類抗生素治療)。接受有創機械通氣治療27例(75%)，9例(25%)接受CPAP或鼻導管氧療。10例(27.78%)曾接受糖皮質激素治療。全部病例TPN時間>3天，8例(22.22%)TPN時間>7天。9例確診患兒中血培養陽性8例，其中白色念珠菌感染為4例，2例為近平滑假絲酵母菌，2例為季也蒙念珠菌，1例為腦脊液墨汁染色鏡檢發現隱球菌。白色念珠菌和季也蒙念珠菌均對氟康唑敏感，近平滑假絲酵母菌1例對氟康唑不敏感，但對兩性霉素B敏感。

2.2G實驗結果比較排除IFI組G實驗結果(16.82±25.65)pg/ml，IFI組G實驗結果(223.19±190.56)pg/ml，兩組比較差異有統計學意義(t’ =-6.48，P< 0.05)。治療7天后IFI組G實驗結果為(33.91±25.63)pg/ml，與治療前IFI組G實驗結果比較，差異有統計學意義(t=6.63，P< 0.05)。

2.3不同陽性值G試驗診斷患兒IFI的敏感度和特異度分別以10、15、20、25、30、40、50 pg/ml作為G實驗陽性值診斷兒童IFI的不同靈敏度和特異度，下表中可見以10或15 pg/ml作為陽性值，可以獲得非常滿意的靈敏度，但是特異度卻很差。而以20 pg/ml 作為陽性值可以獲得滿意的靈敏度(96%)和特異度(75%)，見表1。

表1 不同陽性值G 試驗診斷患兒IFI 的敏感度和特異度 (%)

2.4試驗診斷IFI的ROC曲線見圖 1。曲線下面積為0.882，P= 0.00，95%CI(0.757，1.000)。

圖1 試驗診斷IFI 的ROC 曲線

3 討論

隨著廣譜抗生素和全胃腸外營養的廣泛應用以及侵入性操作的增加，重癥監護病房真菌感染率呈日益增高趨勢。IFI已成為PICU 院內感染的重要原因之一。除了真菌敗血癥這一病癥外，兒童以及新生兒的各個器官都有可能感染真菌，并且在呼吸道有關的肺炎中，很大一部分是由真菌感染導致的，此類肺炎一般病情重，發病時間短，發病速度很快，能夠看到很顯著的影像學的變化[7]。國內外資料表明，深靜脈置管、廣譜抗生素的使用、氣管插管、靜脈脂肪乳輸注以及產前抗生素的使用是早產兒IFI的高危因素[7，8]。劉田田等[9]回顧性分析了104 例早產兒IFI的高危因素，發現低出生體重兒、夏秋冬季、廣譜抗生素、輔助通氣及胃腸道外營養等是早產兒真菌感染的高危因素。其中，輔助通氣及使用脂肪乳時間是真菌感染的獨立危險因素。兒童IFI的臨床表現隱匿，常以非特異性表現為主，然而在臨床表現上可能會有快速惡化的現象。了解IFI的高危因素，對高危兒加強監測和防護，顯得尤為重要。

本研究發現，在IFI組，全部病例均行中心靜脈置管(PICC 28例，CVC置8例)，均在診斷IFI前接受過>7天廣譜抗生素治療(頭孢三代或碳青霉烯類抗生素治療)。接受有創機械通氣治療27例(75%)，10例(27.78%)曾接受糖皮質激素治療。全部病例TPN時間>3天，8例(22.22%)TPN時間>7天。其高危因素與國內外報道接近。

在真菌的細胞壁中，葡萄糖占據真菌質量的比例達到80%～90%，其中1-3-β-D 葡聚糖的質量占據真菌胞壁成分一半以上，特別是對于酵母樣真菌的體內來說，含量會更加高[10]。當真菌感染人體的血液或者人體的深部組織之中時，1-3-β-D 葡聚糖就會在細胞壁中脫離出來，引起血液中含量增高。本研究發現，IFI組治療前G實驗結果為(223.19±190.56)pg/ml，排除IFI組G實驗結果為(16.82±25.65)pg/ml，差異有統計學意義。治療7天后IFI組的G實驗結果為(33.91±25.63)pg/ml，差異有統計學意義。表1顯示，以10或15 pg/ml作為陽性值，可以獲得非常滿意的靈敏度，但是特異度卻很差。而以20 pg/ml 作為陽性值可以獲得滿意的靈敏度(96%)和特異度(75%)。國內報道1，3-β-D葡聚糖檢測不受內毒素或抗生素的影響，靈敏度約90.0%，特異度100.0%[11]。本研究特異度不及其他研究高，即假陽性率稍高于其他研究，考慮可能與部分病例G實驗檢查前應用靜脈丙種球蛋白(IVIG)或白蛋白有關。本研究制作的ROC曲線，曲線下面積為0.882，P= 0.00，95%CI(0.757，1.000)，說明G實驗診斷兒童IFI效果較好，有較高的準確性。

PICU住院患兒，作為兒科特殊群體，因其原發病或并發癥原因，受到多種外因影響，使其成為IFI的易感人群。對易感兒早發現，早疑診，及時進行必要的輔助檢查，提高早期診斷率，及時給予有效治療，以期有效降低病死率。同時，嚴格PICU管理和診療制度、操作的規范化，如減少侵襲性操作、早期微量胃腸內喂養、提高PICU病房內嬰兒母乳喂養率等也是防止真菌性院內感染的有效方法。

G實驗是早期診斷IFI 的有效檢測手段之一，將大幅度提前抗真菌治療的時間，標本采取方法及檢測方法較為方便快捷，具有很大的臨床應用價值。本研究發現，使用20 pg/ml作為G實驗的陽性界值，可以獲得滿意的靈敏度和特異度。