-磷酸三鈣陶瓷多孔結構厚度對釋藥過程影響的體外研究*

袁君杰薛鋒* 張東倪偉峰殷諾 黃曉燕 肖海軍謝幼專

脊柱結核病灶清除術前常搭配使用1～4周的抗結核藥 物治療，術后繼續應用6～9月，以此來加強療效[1]。全身用藥往往難以在病變部位達到有效濃度，同時存在肝腎器官毒副作用[2]。傳統的骨組織缺損修復主要通過自體骨移植實現，但自體骨來源有限，存在供體部位并發癥。選擇合適的支架材料結合抗生素形成藥物緩釋系統可有效解決此類問題，是當前研究的熱點[3-5]。 -磷酸三鈣（ -tricalcium phosphate， -TCP）陶瓷是一種優良的骨組織工程支架材料[6]，不僅能用作修復骨缺損[7,8]，而且在藥物緩釋載體方面的應用也受到廣泛關注[9-11]， -TCP多孔結構內部除有微小孔隙外，還有許多明顯的大孔，孔間相互連通，其結構類似正常松質骨，合適的孔徑和孔內連接確保了其良好的骨傳導性，有利于新骨長入，同時可以釋放藥物。有研究應用多孔 -TCP復合自體干細胞修復動物[12,13]和患者[14]的椎體骨缺損，效果滿意。

藥物從載體中釋放受到藥物本身、藥物與載體結合方式、載體孔徑和孔隙率等多種因素制約，目前 -TCP多孔結構區厚度對藥物釋放的影響尚不明確，為此，本研究設計制備了含貯藥腔的多孔 -TCP作為藥物緩釋載體，通過直接填充法構建了利福平/-TCP藥物緩釋系統，分析其體外藥物釋放特性，明確 -TCP多孔結構厚度對釋藥過程的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

利福平（Sigma-Aldrich，美國）；酶標儀（Synergy HT,Bio-Tek美國）；萬能材料試驗機（Instron，美國）；雙三元液相色譜系統（Ultimate 3000，Dionex，美國）；隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠，中國）；小牛血清（Gibco，美國）；掃描電鏡（HitachiS-4800，日本）；PMMA顆粒（Lucite International 8FAC15，英國）； -TCP粉劑（LuciteInternational，英國）；XRD（Escalab250Xi，Thermo Fisher，美國）。

1.2 方法

1.2.1 -TCP載體設計制備及XRD測試

設計制作2種圓柱狀的多孔 -TCP載體（見圖1），載體直徑為14 mm，高30 mm，載體中心有貯藥腔道，用于貯存藥物，高25 mm，直徑分別為3 mm和8 mm；孔隙率為75%，孔直徑為（500±200） m，孔連接徑為（100±50）m，適合于細胞的黏附、增殖培養和釋放藥物。多孔 -TCP載體是在上海貝奧路生物材料有限公司通過注漿成型法[14]燒結而成。多孔 -TCP載體的物相組成通過X射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）測定（40kv，35mA）。

1.2.2 -TCP載體力學強度測試

使用萬能材料試驗機測定兩種規格 -TCP載體的縱向壓縮強度（n=5）。將圓柱狀的試樣縱向放置在載物臺上，開動測試機，以2mm/min的恒定速度加載試樣，直至試樣破裂。同理，以磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）為介質的藥物緩釋系統，40周后取出 -TCP載體，清除貯藥腔內殘留的利福平，檢測干燥后的載體縱向壓縮強度（n=5）。

1.2.3 -TCP載體結構表征測試

選取力學強度測試后完好的 -TCP碎片，表面噴金后使用掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察 -TCP多孔結構區的表面和斷面形貌并拍照。隨機選取20張低倍（30～100倍）多孔結構SEM圖片，使用Photoshop CC軟件測量大孔和孔內連接的數目、大小，評估單位面積多孔結構的大孔數及孔內連接與大孔數目之比。同理，觀察測定以PBS為介質的藥物緩釋系統40周后 -TCP載體多孔結構大孔和孔內連接徑數目、大小。

1.2.4 體外緩釋實驗

在無菌操作臺內，分別往貯藥腔直徑3 mm和8 mm-TCP載體（n=10）內各填充0.3 g滅菌后的利福平粉劑。接著用無菌硅膠塞在貯藥腔頂端封口，通過魚線將組裝好的藥物緩釋系統與螺旋玻璃瓶蓋子串聯，使其可以懸吊在溶液中，然后用游標卡尺測量出距 -TCP載體頂端5mm的位置，在該位置處纏繞一圈魚線。

體外緩釋實驗的浸提介質分為兩組，一組以PBS為介質（n=5），在玻璃瓶中預裝200mLpH 7.4的PBS，然后將藥物緩釋系統懸吊在PBS中，液面距 -TCP載體頂端5mm。將整個緩釋裝置靜置于37℃的恒溫箱內，每日完全更換等量37℃新鮮PBS。使用酶標儀在波長474 nm處測定洗脫液的吸光度值，根據利福平溶液的標準曲線，計算溶液中利福平濃度，進而計算每日釋藥量和累積釋藥率。另一組以小牛血清（Calf Serum，CS）為介質（n=5），在玻璃瓶中預裝200 mL CS，然后將藥物緩釋系統懸吊在CS中，液面距 -TCP載體頂端5 mm。將整個緩釋裝置靜置于37℃的恒溫箱內，每日微量換液，即每日更換10mL37℃新鮮CS。采用高效液相色譜法測定洗脫液中的利福平濃度，計算每日釋藥量和累積釋藥率。

1.2.5 數據統計分析

實驗數據采用SPSS20.0統計軟件處理。定量資料均采用表示，數據采用獨立樣本 檢驗進行檢驗。＜0.05表示差異有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 制備的 -TCP載體

經高溫燒結之后的兩種規格 -TCP載體如圖1（Ad、Bd）所示。2種多孔 -TCP載體均呈圓柱狀，高30mm，直徑14 mm；載體中央有貯藥腔，高為25 mm，直徑分別為3 mm和8 mm。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP載體質量分別為（3.35±0.03）g、（2.25±0.02）g。

圖1，-磷酸三鈣載體設計圖和實物圖。圖A、B分別為貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -磷酸三鈣載體，圖Aa、Ba為立體設計圖，Ab、Bb為橫截面設計圖，Ac、Bc為縱切面設計圖，Ad、Bd為實物圖。

2.2 -TCP載體XRD測試結果

制備的 -TCP載體的XRD圖譜如圖2所示，試樣各峰度值與 -TCP標準品一致，表明制備的 -TCP載體的物相組成是由鈣和磷組成的，是純粹的 -磷酸三鈣生物陶瓷制品。

圖2，-磷酸三鈣載體XRD圖。

2.3 -TCP載體力學強度測試結果

-TCP載體力學強度測試結果見圖3，原始狀態的貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP的縱向壓縮強度分別為（1.09±0.05）MPa、（0.71±0.04）MPa（＜0.05）。貯藥腔直徑3 mm多孔 -TCP與貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP相比，其縱向壓縮強度增幅達53.52%±7.04%（＜0.05）。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在PBS中浸泡40周后，其縱向壓縮強度分別為（0.62±0.07）MPa、（0.41±0.05）MPa（＜0.05），與緩釋之前相比，其縱向壓縮強度同比下降75.81%±8.06%、73.17%±9.76%（＜0.05）。

圖3，-磷酸三鈣載體緩釋實驗前后力學強度變化圖。*表示＜0.05。

2.4 -TCP載體SEM表征結果

在 -TCP載體多孔結構表面（如圖4-Aa所示）存在許多大孔，多孔結構內部不同的大孔結構可通過孔內連接連通。相鄰大孔結構之間為致密結構，致密結構的磷酸三鈣顆粒之間結合緊密，顆粒棱角分明，邊緣比較銳利，在少數顆粒之間存在微小的孔隙（見圖4-Ac）。多孔結構表面大孔孔徑為（308.9±19.6） m，孔內連接徑為（75.3±12.7） m；單位面積多孔結構表面的大孔數目為（5.64±0.08）/mm2，孔內連接數目為（9.69±0.02）/mm2，孔內連接與大孔數目之比為1.71±0.01。多孔結構斷面（如圖4-Ab所示）大孔孔徑為（540.7±83.0） m，孔內連接徑為（65.3±18.8） m；單位面積多孔結構斷面的大孔數目為（4.61±0.05）/mm2，孔內連接數目為（12.39±0.22）/mm2，孔內連接與大孔數目之比為 2.69±0.58。多孔結構表面和斷面的大孔平均孔徑為（438.7±133.0） m，平均孔內連接徑為（69.6±16.8） m。

經過長達40周的體外緩釋后，載體多孔結構表面大孔邊緣較緩釋之前平整、圓滑（見圖4-Ba），孔徑為（399.4±21.3）m，較緩釋前增大 29.30%±6.90（＜0.05）；孔內連接徑為（98.7±11.7） m，較緩釋前增大31.08%±15.54（＜0.05）；單位面積多孔結構的大孔數目為 (4.53±0.02)/mm2，孔內連接數目為（11.59±0.08）/mm2，孔內連接與大孔數目之比為2.56±0.44，與緩釋之前相比，增幅為 49.71%±25.73（＜0.05）。多孔結構斷面（見圖4-Bb）大孔孔徑為708.7±90.2 m，較緩釋 前增 大 31.07%±16.68（＜0.05）；孔內 連 接徑 為（164.4±14.2） m，較緩釋前增大 51.76%±21.75（＜0.05）；單位面積多孔結構的大孔數目為（2.06±0.05）/mm2，孔內連接數目為（6.51±0.01）/mm2，孔內連接與大孔數之比為3.15±0.35，與緩釋之前相比，增幅為 17.10%±13.01（＜0.05）。體外緩釋40周后， -TCP載體多孔結構表面和斷面的大孔平均孔徑為（614.6±214.4）m，較緩釋前增大40.10%±48.87%（＜0.05）；平均孔內連接徑為（128.3±38.5） m，較緩釋前增大84.33%±55.32（＜0.05）。載體經過長達40周浸泡后，多孔結構孔徑明顯增大，孔內連接數目增多，在相連大孔之間的致密結構也出現內連接孔（見圖4-Bc）。

圖4，-磷酸三鈣載體緩釋實驗前后各部分結構SEM圖。圖A、B分別為緩釋實驗前后載體形貌，圖Aa（×50）、Ba（×30）為多孔結構表面形貌，圖Ab（×30）、Bb（×50）為多孔結構斷面形貌，圖Ac（×1500）、Bc（×1500）為致密結構表面形貌。

2.5 以PBS為介質組的利福平體外緩釋結果

以PBS為介質的體外緩釋組，體外緩釋實驗總共進行了40周，清除載體貯藥腔內殘留的利福平后干燥稱重，貯藥腔直徑3mm和8mm多孔 -TCP質量分別為（3.29±0.02）g、（2.16±0.01）g，其質量較緩釋前同比下降（0.06±0.01）g、（0.09±0.01）g（＜0.05）。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在體外40周的累積釋藥量分別為（234.87±31.75）mg 、（289.02±38.18）mg（＜0.05），其累積釋藥率（如圖5-D所示）分別為78.29%±10.58%、96.34%±12.73%（＜0.05）；利福平每2周累積釋藥率如圖5-C所示，單一多孔結構 -TCP藥物緩釋系統的釋藥曲線波動較大，尤以貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP為載體的藥物緩釋系統最甚，后期釋藥波動幅度變小，趨勢較平穩。在初始的4周，利福平從貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP藥物緩釋系統中每日釋放量見圖 5-A，其累積釋藥量分別為（23.54±3.76）mg、（29.86±4.25）mg（＜0.05），累積釋藥率（見圖5-B）分別為7.85%±1.25%、9.95%±1.42%（＜0.05）。

圖5，以PBS為介質組的利福平體外緩釋結果圖。圖A為緩釋實驗初始4周每天釋藥量。圖 B為緩釋實驗初始4周利福平累計釋藥量，利福平從貯藥腔直徑3 mm和8mm多孔 -TCP藥物緩釋系統中累積釋藥率分別為7.85%±1.25%、9.95%±1.42%（＜0.05）。圖 C 為40周緩釋實驗利福平每2周累計釋藥率。圖D為40周緩釋實驗利福平累計釋藥率，貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在體外40周的累積釋藥率分別為78.29%±10.58%、96.34%±12.73%（＜0.05）。

2.6 以CS為介質組的利福平體外緩釋結果

以CS為介質的體外緩釋組，總共進行了4周實驗。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP負載利福平后，在體外4 周的累積釋藥量分別為（27.54±2.15）mg、（30.95±2.51）mg（＜0.05），其累積釋藥率（如圖 6所示）分別為12.51%±0.72%、13.65%±0.83%（＜0.05）。

圖6，以CS為介質組的利福平體外緩釋結果圖。

3 討論

在脊柱結核病灶清除術后，單一通過全身運用抗結核藥物治療往往療效不確切，這是因為抗生素藥物不能真正到達骨感染部位，特別是在病灶清除術后殘存的壞死或無血管部位。將藥物負載到合適的載體構成藥物緩釋系統可以延長藥物療效、減少毒副反應、提高生物利用率等[15,16]。 -TCP已在臨床上應用于骨組織修復，其無毒和良好的生物相容性已被廣泛認知[8,10,17,18]，本研究設計制備的 -TCP載體通過分析SEM圖片得知，多孔結構大孔平均孔徑為（438.7±133.0）m，孔內連接徑為（69.6±16.8） m，與設計初衷的孔徑范圍基本相符。貯藥腔直徑3 mm多孔 -TCP與貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP相比，其縱向壓縮強度增幅達53.52%±7.04%，說明多孔結構能起到一定的力學強度增幅作用，這與較厚的多孔結構含有的致密結構較多有關。貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP在PBS中浸泡40周后，其質量較緩釋前同比下降（0.06±0.01）g、（0.09±0.01）g（＜0.05），縱向壓縮強度同比下降75.81%±8.06%、73.17%±9.76%（＜0.05），降幅明顯，表明多孔結構 -TCP不易長期維持力學強度，容易降解。

本研究將藥物緩釋系統懸吊在液體中，避免了全浸泡放置時載體部分多孔結構與玻璃瓶壁接觸，從而阻礙了利福平的釋放；懸吊后液面距離載體頂端5 mm，而不是全部處于液體內，是由于硅膠塞在水平標記線（與液面平齊）之上，從而避免因為硅膠塞封閉不緊密，利福平從硅膠塞與載體縫隙間外漏而干擾實驗結果。在載體外圍纏繞一圈魚線具有指示載體入水深度的作用，可以隨時觀測每次換液前后載體入水深度是否一致。

以 PBS為介質的體外緩釋組，貯藥腔直徑3 mm和8 mm多孔 -TCP負載利福平后，在體外40周累積釋藥率分別為 78.29%±10.58%、96.34%±12.73%（＜0.05）。兩種規格 -TCP載體貯藥腔周邊的多孔結構厚度不同，貯藥腔直徑3mm多孔 -TCP貯藥腔周邊多孔結構厚5.5 mm，貯藥腔直徑8 mm多孔 -TCP載體貯藥腔周邊多孔結構厚3 mm，后者在 PBS中40周累積釋藥率是前者的1.23倍（＜0.05），表明多孔結構能控制利福平釋放速率，多孔結構越厚，其藥物釋放速率越慢。每個 -TCP載體負載0.3 g利福平后，單一多孔結構 -TCP藥物緩釋系統釋藥速度較快，其中貯藥腔直徑8mm的藥物緩釋系統在40周的累積釋藥率達96.34%，之后取出載體，發現在載體貯藥腔內有紅褐色的利福平沉積，這可能是因為利福平微溶于PBS，藥物隨時間推移慢慢積聚在一起，類似河床泥沙淤積過程，表明藥物釋放不僅與載體結構有關，還與藥物本身的特性相關。

對于以CS為介質組，之所以采取微量換液，是由于動物血清成本較高，但以CS為介質組可以與體內緩釋過程相對比，故設計了微量換液的CS介質組。在緩釋實驗開始的前4周，在以PBS為介質的溶液中，貯藥腔直徑3mm和8 mm多孔-TCP藥物緩釋系統的累積釋藥量分別為（23.54±3.76）mg、（29.86±4.25）mg，累積釋藥率分別為7.85%±1.25%、9.95%±1.42%；以 CS為介質組的累積釋藥量分別為（27.54±2.15）mg、（30.95±2.51）mg，其累積釋藥率分別為12.51%±0.72%、13.65%±0.83%。兩種規格 -TCP載體構建的藥物緩釋系統以CS為介質組其利福平釋放量高于以PBS為介質組，這可能與利福平藥物特性有關，利福平微溶于水、PBS，易溶于有機溶劑，是疏水性物質，而動物血清中含有大量蛋白質，蛋白質是兩性分子，含有疏水端和親水端，能結合溶液中的利福平，溶液中游離的利福平減少，使載體內外溶液的利福平濃度梯度增大，從而增加利福平的釋放。

影響磷酸鈣載體釋藥的因素主要有被負載藥物的擴散系數、載體材料孔徑和孔隙率的大小及侵入或包裹載體的物質濃度等。藥物的擴散系數、材料的孔徑和孔隙率越大，侵入或包裹物的濃度越低，藥物釋放越快，反之亦然[19]。韓辰等[20]研究發現孔隙率可顯著改變 -TCP結構，并影響釋藥速率，有望用于控制載藥 -TCP陶瓷載體的緩釋過程。本文研究表明藥物從緩釋系統中的釋放特性不僅與多孔 -TCP載體的多孔結構厚度有關，還與藥物本身的特性、洗脫液類型有關，-TCP多孔結構厚度能有效控制藥物的釋放。保持利福平濃度在（0.005-0.5）g/mL可以殺滅結核分枝桿菌[21,22]。在本部分體外研究中，多孔 -TCP載體負載利福平后在PBS洗脫介質中能夠緩釋長達40周以上，釋藥濃度均在治療濃度之上，有望用于脊柱結核術后椎體缺損的治療。