基于CdSe@ZnS量子點水溶性納米粒子的制備及熒光性能

莊慶一， 由芳田， 彭洪尚

(1. 北京交通大學光電子技術研究所 發光與光信息教育部重點實驗室， 北京 100044；

1 引 言

量子點，又可稱為半導體納米晶體，自上世紀70年代末起就引起了包括物理學家、材料科學家、化學家和電子工程學家等科研人員的廣泛關注。與傳統的有機染料相比，量子點具有窄的半峰寬、覆蓋可見光-近紅外區域的可調發射波長、高的熒光效率和穩定性[1-2]，因此在生物醫學領域具有重要的意義，如可用于熒光標記、細胞追蹤、癌癥治療等[3-6]。

量子點的合成方法主要分為水相合成法與油相合成法。1996年，Meller首次在水相中合成了硫醇穩定的CdTe量子點[7]。水相合成的量子點表面通常含有巰基配體[8-9]，因此有利于后續的生物功能化。雖然水相合成的方法簡單、毒性小、成本低，量子點具有良好的親水性和生物兼容性，但其量子效率較低且半峰寬較寬，這極大地限制了其在熒光檢測與成像中的應用[10]。相比較而言，在有機溶劑中利用金屬有機化學法可制備高發光質量的量子點，這也是迄今為止最成功的方法[11-14]。該方法的機理是利用金屬有機化合物前驅體在高溫下迅速成核，通過控制體系的反應溫度和前驅體的反應量來控制量子點的生長，同時利用油溶性配體對量子點表面的吸附來阻止量子點長大，并穩定量子點。令人遺憾的是，油相合成的量子點無法直接應用于生物標記，需采用配體交換[15-16]或者表面包覆(采用二氧化硅[17-19]、高分子[20]等材料)等方案來提高其水溶性和生物兼容性。配體交換法或者表面包覆法不僅大大增加了制備過程的復雜程度，而且在轉到水相后量子點的發光效率會明顯降低[21]。因此，發展一種量子點由油溶轉水溶、且保持發光性能不發生改變的簡易方法，對于推進量子點在生物醫學領域中的應用具有重要的意義。

在之前的研究工作中，我們發展了一種基于疏水相互作用及硅氧烷水解縮聚反應來制備水溶性納米粒子的方法，即再沉淀-包覆法[22]?？紤]到量子點為油溶性的特點，這啟發我們利用上述方法或許可容易實現對油溶性量子點的溶解性轉變。在本文中，我們首先制備了油溶性、核殼結構的CdSe@ZnS量子點，然后利用再沉淀-包覆法將其包覆到水溶性納米粒子中。所制備的CdSe@ZnS摻雜納米粒子具有小的粒徑(～45 nm)、良好的生物兼容性(表面為多聚賴氨酸殼層，PLL)和高的熒光強度(單個顆粒內包覆數十個量子點)。將其與腫瘤細胞培育，可實現對細胞的多色熒光標記?？紤]到所發展的納米粒子制備方法無需復雜的配體交換和表面修飾步驟，一步即可實現量子點由油相到水相的轉變，因此對于量子點的生物醫學應用具有積極的推動作用。

2 實 驗

2.1 材料與儀器

材料：硬脂酸鎘(CdSt2)、硒粉(Se)、三丁基磷(TBP)、正辛胺、己烷、甲醇、十二烷、油胺、硬脂酸鋅(ZnSt2)、二乙基二硫代氨基甲酸鋅(Zn-(DDTC)2)均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，聚苯乙烯(PS)、多聚賴氨酸(PLL)、十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)、四氫呋喃(THF)均購自Sigma-Aldrich。

儀器：采用日立公司型號為JEM 1400EX透射電子顯微鏡對納米顆粒進行形貌表征；利用馬爾文公司生產的型號為Nano ZS90的激光粒度儀測試納米顆粒的動態光散射粒徑(DLS)；熒光分析使用的是日立公司生產的型號為F-4600的熒光光譜儀；熒光衰減采用法國HORIBA Jobin Yvon公司的TCSPC熒光壽命光譜儀測試。

2.2 油溶性CdSe@ZnS量子點的合成

核殼結構CdSe@ZnS量子點的制備采用晶種生長法[23]。以合成紅光量子點為例，在50 mL四口瓶中，CdSt2溶液加熱到250 ℃，將1.2 mL硒懸濁液快速注入到四口瓶中，控制注入硒懸濁液的量和反應時間使量子點的尺寸達到3 nm(綠光1.2 nm)。在50 ℃的溫度條件下，將三丁基磷和正辛胺分別注入到CdSe量子點的反應溶液中攪拌，再將己烷和甲醇混合溶液注入攪拌，完成原位萃取提純，獲得CdSe種子。包覆采用連續離子吸附生長法，取3 mL十二烷、3 mL油胺和提純過的CdSe溶液混合加入到50 mL四口瓶中，150 ℃下反應。Zn(DDTC)2作為包覆1～6層的前驅體加入，ZnSt2和Zn(DDTC)2作為包覆7～8層的前驅體加入，整個實驗過程一直處于氮氣保護狀態。反應結束后對產物沉淀離心，再分散到THF中。

2.3 CdSe@ZnS摻雜水溶性納米粒子的制備

分別配置PS(2×10-3)、DTS(2×10-3)和CdSe@ZnS量子點(4×10-4)的THF溶液，然后按照50∶46∶4的質量比取適量體積混合成總濃度為1×10-3的溶液。用移液槍取200L上述混合溶液，在超聲條件下迅速注入8 mL去離子水中(pH=9，氨水調節；含有160g PLL)。靜置2 h后，通入N2以移除THF，即得到CdSe@ZnS摻雜的水溶性熒光納米粒子。

2.4 MTT實驗

將肝癌細胞(HepG2)均勻接種到96孔板中，每孔5 000個細胞，培養24 h。細胞分為實驗組和對照組，在實驗組加入不同濃度梯度的熒光納米粒子溶液，對照組只需加入等量的完全培養基。24 h后，每孔中加入20L的MTT溶液(5 mg/mL溶于PBS中)，放入細胞培養箱中培養4 h后，吸走廢液，每孔加入0.15 mL的DMSO溶液。避光條件下，將96孔板放入酶聯免疫監測儀中振蕩10 min，選擇490 nm波長，檢測每孔中的吸光值。利用公式計算細胞存活率：細胞存活率(100%)=(實驗組OD平均值/對照組OD平均值)×100%。

2.5 共聚焦顯微鏡成像實驗

HepG2細胞在35 mm共焦培養皿中培養1天，細胞密度為1×105個，再加入熒光納米粒子溶液培養24 h，之后用PBS洗滌細胞3次，在激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon Ti-E 全電動倒置顯微鏡)下進行熒光成像。G-NPs和R-NPs在405 nm波長下激發，收集波段分別為500～550 nm和580～630 nm。

3 結果與討論

3.1 CdSe@ZnS量子點的制備與表征

油溶性CdSe@ZnS量子點的制備采用晶種生長法[23]，其合成機制是先制備CdSe量子點內核，然后通過調整ZnS包覆層的厚度來調節量子點的發射波長。本論文以發射綠光(G-QDs)和紅光的CdSe@ZnS量子點(R-QDs)為例，包覆的ZnS殼層層數分別為6層和8層。所制備綠光G-QDs量子點的發射波長峰值位于529 nm，如圖1(a)右下插圖所示，紅光R-QDs量子點發射波長為610 nm，如圖1(b)右下插圖所示。 CdSe@ZnS量子點的透射電鏡(TEM)照片如圖1所示。由圖中可以看出，G-QDs量子點的形狀基本為球形，粒徑約為2.5 nm；而隨著包覆層數的增加，R-QDs量子點增大至～4 nm，且形狀逐漸偏離圓形。量子點形貌變化是外延生長的一個必然結果，因為隨著ZnS層數的增加，殼層的體積占整個量子點體積比逐漸增大，量子點的晶格常數會慢慢趨近體相ZnS水平。

圖1 核殼結構CdSe@ZnS量子點的透射電鏡照片。(a)G-QDs;(b)R-QDs。量子點的粒徑統計見右上插圖，THF中的熒光發射光譜見右下插圖。

3.2 CdSe@ZnS摻雜水溶性納米粒子的制備與表征

利用再沉淀-包覆法將CdSe@ZnS摻雜到水溶性納米粒子中，實現CdSe@ZnS量子點由油溶到水溶的轉相[22]。其制備原理是：(1)疏水性物質因為局域環境由非極性到極性的劇變而發生聚集，進而形成納米粒子；(2)納米粒子中有機硅氧化在堿性環境中的快速水解和縮聚而在粒子表面形成SiO2殼層；(3)水溶液中帶正電的PLL分子與納米粒子表面負電SiO2殼層的吸引而形成PLL外包覆層。圖2(a)為制備的摻雜G-QDs量子點綠光納米粒子(G-NPs)的TEM照片，經統計得到G-NPs的粒徑為50 nm左右，這與動態光散射(DLS)得到的水力學粒徑也基本相符(圖2(b))。另外，在納米粒子上可以觀察到數目眾多的黑色小點。由于納米粒子的基質主要成分為有機物(PS，DTS和PLL)，量子點具有更高的電子密度，因此可以斷定其上的黑點即為所摻雜的CdSe@ZnS量子點，即量子點的確摻雜到了水溶性納米粒子內。納米基質的保護作用可以大大降低CdSe@ZnS量子點的外泄幾率，因此可減小其生物毒性；同時，PLL殼層的包覆使得納米粒子具有良好的水溶性和生物兼容性，且表面荷正電的氨基有利于納米粒子通過胞吞作用進入細胞[22]。摻雜R-QDs量子點的紅光納米粒子(R-NPs)具有相同的實驗結果，在此不再贅述。

圖2 摻雜綠光CdSe@ZnS量子點的納米粒子(G-NPs)。(a)透射電鏡照片，左上插圖為粒徑統計分布；(b)動態光散射粒徑分布。

圖3為CdSe@ZnS量子點摻雜到納米粒子前后的發射光譜。由圖中可以看出，量子點在納米粒子中的發射波長相比于在THF中均發生了紅移，移動距離分別為5 nm(G-QDs)和3 nm(R-QDs)?？紤]到量子點表面原本吸附有機配體(三丁基膦和油胺)，摻雜到PS-DTS為基質的納米粒子后其周圍微環境的介電常數變化較小，因此可以忽略介電限域效應的影響。我們注意到，在納米粒子內CdSe@ZnS量子點是隨機分布的，如圖2(a)所示，因此當相互之間距離足夠近時則會通過電偶極-電偶極相互作用而產生能量傳遞。由于量子點本身存在尺寸差異，能量傳遞的結果是小尺寸量子點(具有短發射波長)將激發能傳遞給大尺寸的量子點(具有長發射波長)，從而使得摻雜納米粒子的整體發射波長向長波側移動，即發生紅移[24-25]。此外，由圖3可以看到CdSe@ZnS量子點在摻雜到水溶性納米粒子前后的半峰寬保持不變，表明量子點在納米粒子內以單分散的形式存在，沒有發生聚集。這與通過TEM照片觀察到的結果也一致。

圖3 CdSe@ZnS量子點在THF(虛線)和納米粒子中(實線)的熒光發射光譜。左側為綠光量子點，右側為紅光量子點，激發波長為365 nm。

為進一步研究CdSe@ZnS量子點在納米粒子內的發光特性，對綠光和紅光量子點摻雜到納米粒子前后的熒光強度衰減進行了測量，結果如圖4所示?？梢郧宄乜吹?，量子點在摻雜到納米粒子后熒光強度的衰減速率均加快。對于THF溶液中量子點的熒光衰減采用雙指數函數可得到較好的擬合結果：

I(t)=A1exp(-t/τ1)+A2exp(-t/τ2)，

(1)

其中，τ1和τ2分別代表量子點中與本征激發態和表面缺陷態相關的熒光壽命，A1和A2代表不同衰減成分在t=0時的幅度[26]。而對于納米粒子中量子點的熒光強度衰減，雙指數函數無法得到合理的擬合結果，須采用三指數函數進行擬合：

I(t)=A1exp(-t/τ1)+

A2exp(-t/τ2)+A3exp(-t/τ3)，

(2)

其中，τ1和τ2具有與公式(1)中相同的物理意義，τ3則認為是與能量傳遞(量子點濃度)相關的熒光壽命[27]，A1、A2和A3分別代表不同衰減成分在t=0時的幅度。熒光強度衰減擬合得到的參數如表1所列，平均壽命τav依據下列公式計算得到:

(3)

分析表中擬合數據可以得到如下結論：量子點在摻雜到納米粒子后本征態短熒光壽命τ1變化不大，然而表面缺陷態的長壽命τ2卻顯著變短，并且與能量傳遞相關的熒光壽命τ3具有最長的壽命。顯然，在納米粒子內的摻雜并沒有改變量子點內激子的本征躍遷速率，因此τ1變化較??；納米粒子內固體基質對量子點表面有機配體的影響則比較明顯，可能導致與表面態相關的無輻射弛豫速率增加，從而引起τ2壽命變短；納米粒子內量子點之間相互能量傳遞的結果，最終使得激發能或通過本征態或通過表面態輻射(或無輻射)弛豫掉，因此壽命τ3顯著慢于τ1和τ2。后兩者共同作用的結果使得納米粒子的熒光強度的衰減要快于量子點的衰減，即τav(NPs)<τav(QDs)。這也與表1中的實驗結果相一致。

圖4 CdSe@ZnS量子點摻雜到納米粒子前后的熒光強度衰減。(a)綠光量子點；(b)紅光量子點。激發波長為453 nm，監測波長分別為520 nm和609 nm。散點為實驗數據，實線為對應的擬合函數。

表1 CdSe@ZnS量子點在THF和納米粒子中熒光衰減的雙指數和三指數函數擬合數據結果

3.3 CdSe@ZnS摻雜納米粒子的細胞毒性與熒光標記

由于CdSe@ZnS摻雜納米粒子在保持量子點原有光學特性的同時，具有良好的水溶性、穩定性、高的熒光強度(單個粒子內摻雜數目眾多的量子點)，因此非常有利于進行生物熒光標記。在進行生物標記前首先利用MTT法對納米粒子的生物毒性進行了測試。MTT測試的原理是利用活細胞線粒體中產生的琥珀酸脫氫酶將MTT還原成不溶于水的甲臜，而死細胞沒有該功能。利用DMSO將甲臜溶解，測定它在490 nm波長下的吸光度，通過吸光度來評估細胞的存活率。以紅色納米粒子(R-NPs)為例，由圖5(a)所示的MTT測試結果可知，當R-NPs的濃度小于30g/mL時，細胞活性基本不被抑制。這說明PLL包覆的納米粒子具有良好的生物兼容性，對細胞增殖影響小，從而可以忽略摻雜于其中的量子點的細胞毒性。在后續實驗中均采用30g/mL的劑量進行細胞實驗。

圖5 (a)與不同濃度CdSe@ZnS摻雜納米粒子(R-NPs)孵育后HepG2細胞的活性，R-NPs的濃度分別為0，10，20，30，40 g/mL；(b)吞噬G-NPs(上)與R-NPs(下)細胞激光共聚焦顯微鏡照片。共聚焦成像的激發波長405 nm，綠光和紅光的成像通道分別為500～550 nm和580～630 nm。

隨后對吞噬了納米粒子的HepG2細胞進行了激光共聚焦掃描成像的研究。分別利用綠光和紅光通道成像，可以清楚地觀察到細胞內G-NPs和R-NPs納米粒子的發光，如圖5(b)所示。顯然，CdSe@ZnS摻雜納米粒子可以有效地被細胞吞噬。從圖中可以看出，納米粒子隨機分布于細胞質以及其他除細胞核之外的細胞器中。這主要是由于納米粒子帶正電的PLL殼層與其他生物分子的非特異性吸附所致。此外，由于納米粒子尺寸相對較大，在細胞核中觀察不到納米粒子的存在。

4 結 論

本文報道了一種用于生物熒光標記的CdSe@ZnS量子點摻雜水溶性納米粒子。首先通過高溫注入的方法合成了具有優良光學特性的CdSe@ZnS量子點，其在油相中具有高的熒光強度與穩定性。然后采用再沉淀包覆的方法使量子點成功轉移到水相中，無需配體交換等繁瑣步驟，且能保持量子點原有的光學性能。對量子點摻雜納米粒子的發光特性進行了研究，發現其發射光譜較摻雜前發生少量紅移，且熒光壽命縮短。究其原因，認為主要是量子點之間能量傳遞的結果。最后對其生物毒性和熒光標記性能進行了研究，證明其具有良好的生物相容性和生物標記能力。該工作提供了一種將油溶性量子點轉到水相的簡易方法，為拓展量子點在生物標記方面的應用提供了有益的參考。