花青素對大豆分離蛋白結構影響及其復合物抗炎能力

李 楊，鄒曉霜，李佳妮，李 紅，齊寶坤，王中江，江連洲，隋曉楠*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）由豆粕低溫提取，富含多種必需氨基酸并具有特定的空間結構，是一種安全可靠又經濟實用的蛋白資源，其氨基酸分數近乎等同于動物蛋白，還可滿足乳糖不耐癥患者的需求[1-2]，能取代動物蛋白[3]，但SPI的加工特性還不能滿足現代工業的需求[4]。目前除傳統物理、化學、生物改性外，利用酚類來改善蛋白質的加工特性是一個全新的領域[5]。

研究表明，在一定條件下蛋白質可以與酚類物質發生相互作用形成相對穩定的衍生物[6-7]。食品工業中，產品研發和加工制造的核心研究目的是提高食品的營養和功能品質，向原食物組分中加入酚類物質，既可提高產品營養性、豐富性[8]，還在一定程度上提高蛋白的加工特性以及改善生物學活性[9]，但酚類物質都不可避免地會與蛋白質等生物大分子發生相互作用[10]。其中，花青素是一種黃酮類純天然活性物質，由于具有抗氧化、抗炎等生物活性被廣泛應用于保健、食品、醫藥等領域[11-12]。目前，國內外對于蛋白與酚類互作的研究主要局限在非共價復合，Asquith等[13]發現多酚與蛋白的結合能力與種類有關。劉勤勤等[4]研究了茶多酚與SPI的相互作用。姚惠芳等[14]研究了篤斯越橘花青素與牛血清白蛋白的相互作用；對于共價復合的研究相對較少，Tantoush等[15]發現β-乳球蛋白與酸櫻桃酚共價復合后致敏性降低。Prodpran等[7]發現魚肌原纖維蛋白與多種酚類共價復合后，蛋白加工特性增強。Rawel等[16]發現大豆球蛋白與多種酚類共價復合后，蛋白質溶解性改變，等電點偏移。目前國內對于花青素與蛋白的非共價相互作用已經進行了一些報道，但對于花青素與SPI共價相互作用的機理研究尚存空白。

針對上述問題，本實驗探究了在堿性條件下不同質量濃度花青素與SPI互作，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、熒光光譜、圓二色光譜等對蛋白結構進行分析，并建立以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導的Raw264.7體外細胞炎癥模型，通過對腫瘤壞死因子TNF-α以及NO的分泌量，測定SPI對花青素抗炎能力的影響。本研究為花青素與SPI共價相互作用的研究提供了理論方法和指導意義，并為進一步研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；黑米提取物 中國山西天之潤生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒 中國Solarbio公司；乙腈、甲酸（均為色譜純）、LPS 美國Sigma-Aldrich公司；RAW264.7小鼠單核巨噬細胞 中國科學院上海生科院細胞資源中心；3 kDa超濾離心管 美國Millipore公司；Griess試劑 中國碧云天生物技術有限公司；TNF-α ELISA試劑盒 中國上海哈靈生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液 美國Gibco BRL公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

F-4500型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；W A T 0 2 3 6 3 5高效液相色譜儀、C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，2.5 μm） 美國Waters公司；GL-25MS超速高速冷凍離心機 上海盛析儀器設備有限公司；J-810圓二色光譜儀 日本Jasco公司；SPCH-10超高壓納米均質機 安盛聯合科技有限公司；PHS-25型酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；BSM電子分析天平 上海亭衡衡器有限公司；JJ-1電動攪拌器金壇市天竟實驗儀器廠；KDN-04B消化爐 上海昕瑞有限公司；RE201D旋轉蒸發儀 中浮儀器設備有限公司；RVC 2-18真空離心濃縮儀 德國Christ公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；ULTRATURRAXUTL 2000乳化機 德國IKA公司；Tecan M200 PRO多功能酶標儀 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Torrezan等[17]的方法，用粉碎機將大豆粉碎后過60 目篩網，按1∶3（g/mL）用正己烷脫脂豆粉3次。脫脂豆粉置入通風櫥中12 h除去正己烷。將脫脂豆粉溶解于去離子水中，用2 mol/L的NaOH溶液調節溶液pH值至9.0并充分攪拌，4 ℃、14 000×g離心20 min取上清液，用2 mol/L的HCl溶液調節溶液pH值至4.5，4 ℃、4 000×g離心20 min棄去上清液，將沉淀用去離子水充分水洗3 次后，用2 mol/L的NaOH溶液將溶液pH值調至7.0。樣品經-40 ℃預凍24 h后冷凍干燥，研磨后得到SPI（根據GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》蛋白質質量分數為（90.5±0.30）%）。

1.3.2 黑米提取物中花青素的提純及主要成分的鑒定

花青素的提純參考Sui Xiaonan等[18]的方法，稱取10 g黑米提取物，將黑米提取物與去離子水按1∶10（g/mL）配制成混合液后進行減壓抽濾。將濾液進行固相萃取分別依次加入0.01 mol/L的HCl-乙酸乙酯-甲醇（5∶4∶4，V/V），最后采用旋轉蒸發去除甲醇得到花青素提純樣品。

花青素主要成分的鑒定，取50 μL溶于甲醇的花青素樣品于EP管中，用真空濃縮儀除去甲醇后加入50 μL去離子水經振蕩器混勻，取20 μL樣液稀釋至10 mL并過0.45 μm濾膜，單次進樣量50 μL，流速1 mL/min，流動相A為5%甲酸，流動相B為100%乙腈，梯度0～5 min流動相A為100%，流動相B為0%；20 min流動相A為90%，流動相B為10%；40 min流動相A為87%，流動相B為13%；44 min流動相A為80%，流動相B為20%；50 min時流動相A為75%，流動相B為25%，55 min時流動相A為0%，流動相B為100%。柱溫25℃，檢測器波長520 nm。

最終檢測結果黑米提取物中花青素主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，根據擬合曲線計算最終純度為（89.40±0.02）%，可認為純品，相對分子質量按449.38計算。將旋轉蒸發后得到的提純樣品溶于0.01 mol/L的HCl溶液中配制成50 mg/mL的花青素母液，于－20 ℃冷凍保存備用。

1.3.3 SPI與花青素的共價復合

參考Rawel等[19]的方法稍加修改，用去離子水配制質量濃度為20 mg/mL的SPI溶液，500 r/min磁力攪拌2 h以確保蛋白充分溶解，分別加入50 mg/mL的花青素母液，調節溶液pH值至9.0后加入去離子水并定容使蛋白最終質量濃度為10 mg/mL，并分別使花青素最終質量濃度為1.000、0.500、0.250、0.167、0.125 mg/mL，加入質量分數為0.02%疊氮化鈉防止微生物滋生，并在室溫下500 r/min磁力攪拌16 h，然后將部分樣品在4 000×g于3 kDa超濾離心管中離心20 min以除去游離花青素，凍干后用于結構測定。其余樣品直接凍干，花青素對照組經相同處理后凍干。

1.3.4 溶解度測定

參考Morr等[20]的方法，將樣品分散于10 mL的去離子水中，然后用0.1 mol/L的NaOH或HCl溶液調節溶液pH值（pH 2～10），500 r/min條件下磁力攪拌30 min，隨后4 ℃、14 000×g離心20 min。取上清液，采用微量凱氏定氮法測定蛋白質含量。蛋白質溶解度計算公式如下：

1.3.5 SDS-PAGE檢測

根據Liu Fuguo等[21]的方法稍加修改，將20 μL樣品稀釋于含有β-巰基乙醇的2×上樣緩沖液中，于95 ℃加熱90 s變性處理。分別配制12%和5%的分離膠與濃縮膠，上樣量為10 μL，電泳過程電壓恒定，濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓120 V。染色劑為0.25 g/L考馬斯亮藍R-250（0.25 g考馬斯亮藍R-250、400 mL甲醇、70 mL冰乙酸定容至1 L），電極液為甘氨酸14.41 g、Tris 3.03 g、SDS 1.0 g定容至1 L，脫色液A為甲醇-冰乙酸-水（40∶7∶53，V/V），脫色液B為甲醇-冰乙酸-水（5∶7∶88，V/V）。

1.3.6 熒光光譜分析

根據王中江等[22]的方法，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）分別將樣品稀釋至0.2 mg/mL，在280 nm波長處激發，測定波長范圍為300～400 nm，掃描速率60 nm/s，激發條帶寬度10 nm，激發和發射狹縫均為10 nm，每組樣品重復測定3 次。

1.3.7 圓二色光譜

根據Rawel等[19]的方法。分別稱取一定量的樣品，溶于磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L pH 7.0）中，使得蛋白質量濃度為0.25 mg/mL，樣品池光程為1 mm，實驗溫度25 ℃，掃描速率100 nm/min，分辨率0.1 nm。采用CDpro曲線擬合軟件包分析復合物的二級結構組成使用的參考蛋白為SMP56，取蛋白平均殘基摩爾質量為115 g/mol，計算波長范圍為200～240 nm，每組樣品重復測定3 次。

1.3.8 體外Raw264.7炎癥細胞模型的建立

Raw264.7細胞采用DMEM完全培養基（10%的FBS、4 mmol/L的L-谷氨酰胺、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素）于25 cm2帶蓋透氣斜口培養瓶中，并在無菌培養箱中37 ℃、5% CO2孵育；當細胞融合至70%～80%時進行傳代處理，棄去細胞培養液，用磷酸鹽緩沖液沖洗后，加入DMEM培養基2 mL并用細胞刮刀將貼壁細胞刮落，以1∶2的比例進行細胞傳代，選取5 代后細胞用于實驗；使用無FBS、無雙抗的DMEM培養基溶解花青素以及花青素與未超濾SPI的復合物凍干樣。當細胞密度達到105個/mL時將細胞接種于24 孔平板中，在37 ℃、5% CO2無菌培養箱用不含FBS、雙抗的DMEM培養基饑餓處理24 h后，分別用花青素以及未超濾SPI-花青素的復合物孵育細胞4 h，最后以質量濃度10 ng/mL的LPS孵育24 h。

1.3.9 MTT法檢測細胞活性

采用MTT法檢測花青素以及SPI-花青素復合物對RAW264.7細胞的增殖作用。取對數生長期的RAW264.7細胞，細胞密度達到5×104接種于96 孔細胞養板中，分別加入不同質量濃度花青素以SPI-花青素的復合物，補充無FBS、無雙抗DMEM培養基至200 μL并使樣品最終質量濃度為50、100、200 μg/mL，對照組加入無FBS、無雙抗DEME培養基。在5% CO2、37 ℃培養箱中孵育24 h后，棄去培養基，每孔加入MTT試劑20 μL，在培養箱中4 h后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min后檢測570 nm波長的光密度，計算細胞活力。

1.3.10 TNF-α及NO含量的測定

Raw264.7細胞經LPS處理24 h后，用無菌離心管收集細胞懸液，1 000 r/min離心20 min，收集上清液，測定不同質量濃度花青素以及SPI-花青素復合物處理Raw264.7細胞后TNF-α的分泌量，采用酶聯免疫吸附試劑盒，具體操作按說明書進行，以空白孔調零，450 nm波長處測定各孔OD值，每實驗組重復3 次。氮氧化物含量的測定，采用NO檢測試劑盒，具體操作按說明書進行，540 nm波長處測定各孔OD值，每實驗組重復3 次[23]。

1.4 數據統計方法

使用Statistics 8進行ANOVA差異顯著性分析和方差分析（P＜0.05為顯著性差異），若P值小于0.05，使用Duncan’s multiple range test進行多重比較。采用Sigma Plot軟件進行圖譜分析和圖表制作。每個實驗重復3 次，結果表示為 ±s。

2 結果與分析

2.1 復合物溶解性的變化

圖1 花青素質量濃度對SPI溶解性的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of anthocyanins on the solubility of SPI

食物組分中蛋白質的溶解性與乳化性、凝膠性、持水性等加工特性息息相關。凱氏定氮法測定SPI與不同質量濃度花青素復合后溶解度的變化情況（pH 2.0～10.0），如圖1所示，SPI的溶解度隨花青素質量濃度增加呈下降趨勢，等電點略微向pH值增大方向偏移，且當SPI與1.000 mg/mL質量濃度的花青素復合時溶解度最低。SPI主要由球蛋白組成，這種蛋白質分子極性集團朝向外部，可以與極性的水分子相互作用[24]，當加入花青素后，可能是由于在堿性條件下SPI的側鏈氨基酸極性集團與花青素的酚羥基結合，導致蛋白質分子體系極性下降，溶解度降低。Rawel等[16]曾研究過大豆球蛋白與多種酚類物質堿性條件下共價復合，結果表明大豆蛋白溶解性的改變與所加入酚的種類有關。

2.2 SDS-PAGE分析

圖2 花青素質量濃度對SPI亞基組成的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of anthocyanins on subunit composition of SPI

SDS-PAGE具有較高的靈敏度的蛋白質分離技術，可根據亞基的分子質量在電泳的過程中呈梯度逐漸分開[25]。由圖2可以看出，隨著花青素質量濃度的增加，分子質量在63～75 kDa的亞基與20～35 kDa的亞基逐漸消失，并伴隨著超高分子質量亞基的與色散帶的生成，花青素質量濃度為1.000 mg/mL條帶現象最為明顯。Liu Fuguo等[26]研究乳鐵蛋白與綠原酸相互作用，會導致乳鐵蛋白亞基的分子質量稍有增加的趨勢；Rawel等[16]對大豆球蛋白與綠原酸、咖啡酸、楊梅素、槲皮素在堿性條件下互作時均出現超大分子質量亞基的生成。在Liu Fuguo[26]、與Rawel[16]等的實驗結果中未觀察到低分子質量亞基的消耗，可能由于未進行對酚類物質添加質量濃度進行探究，由于花青素分子質量遠小于大豆蛋白，因此圖中高分子質量亞基條帶的生成，可能是由于花青素與蛋白互作后，使蛋白質不同亞基之間發生聚合形成大分子亞基，而非花青素與亞基結合所產生。

2.3 熒光分析

圖3 花青素質量濃度對SPI熒光強度的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of anthocyanins on fl uorescence intensity of SPI

一般色氨酸殘基與酪氨酸殘基是蛋白質的主要內源熒光源，易受微環境極性的影響，因而可用作研究蛋白質與小分子物質相互作用的依據。本實驗采用內源熒光分析方法研究了花青素與SPI復合后對蛋白質三級結構的變化。在280 nm波長下激發的SPI樣品熒光發射光譜主要發色基團為色氨酸與酪氨酸。由圖3可知，花青素對SPI熒光具有明顯的猝滅作用，在一定質量濃度SPI溶液條件下，花青素質量濃度的升高會引起SPI熒光強度的降低，表明花青素與SPI相互作用時，將位于內部的疏水基團暴露于水相中，導致蛋白發生熒光猝滅。同時，最大發射峰λmax紅移，由波長337.6 nm處偏移至339.6 nm處，表明蛋白質內部結構中的發色基團在溶液中所處的微環境極性提高，肽鏈變得更加伸展。許銘珠等[27]根據猝滅常數判斷葡萄皮花青素與5 種蛋白相互作用的均為靜態猝滅。劉勤勤等[4]發現茶多酚會導致SPI熒光光譜紅移，與本實驗結果一致。

動態猝滅及靜態猝滅是引起SPI熒光猝滅的主要機制。動態猝滅過程中，升溫會導致猝滅常數隨著溫度的升高而增加；反之，靜態猝滅的猝滅常數降低。因此，可通過Stern-Volmer方程，根據不同溫度下熒光強度的改變判定猝滅機制，公式如下：

式中：F0為未加入花青素時SPI的熒光強度；F為加入花青素后SPI的熒光強度；[Q]為花青素的總濃度/（mol/L）；KSV為動態猝滅常數/（L/mol）；Kq為雙分子猝滅速率常數/（L/（mol·s））；τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命（通常生物大分子的平均壽命約為10-8s[28-29]）。

表1 花青素對SPI的猝滅常數Table 1 Stern-Volmer quenching constants

各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數約為2.0×10 L/（mol·s），若Kq大于2.0×1010L/（mol·s）時為靜態猝滅；若Kq小于2.0×1010L/（mol·s）時為靜態猝滅。不同溫度下花青素對SPI的猝滅常數結果見表1，顯然花青素對SPI的猝滅機制主要為靜態猝滅，這進一步說明花青素與SPI形成了不發光的復合物，從而導致SPI熒光強度降低。

2.4 圓二色光譜分析

選擇紫外光譜范圍為190～240 nm，測定不同質量濃度的花青素與蛋白質復合后的圓二色吸收，由圖4可以看出，在光譜范圍為200～230 nm時蛋白質的平均殘基摩爾橢圓度[θ]發生了改變，通過CONTIN/LL程序計算，結果見表2。

圖4 不同質量濃度花青素與SPI復合物的圓二色光譜Fig. 4 CD spectra of SPI complexes with different concentrations of anthocyanins

表2 花青素質量濃度對SPI的二級結構的影響Table 2 Effect of different concentrations of anthocyanins on protein secondary structure of SPI

SPI與不同質量濃度花青素復合后，二級結構含量發生了明顯變化。如表2所示，隨著花青素質量濃度的增加，α-螺旋結構含量降低，β-折疊含量上升，轉角結構變化不明顯，當花青素質量濃度為1.000 mg/mL時，無規則卷曲含量明顯增加?？赡苁怯捎讦?螺旋結構中的疏水性氨基酸區域，從而使肽鏈延伸改變其空間構象。Ali等[30]研究牛奶的乳清蛋白與咖啡酸相互作用導致二級結構中的無規則卷曲含量升高。Liu Fuguo等[26]研究乳鐵蛋白與綠原酸、沒食子酸堿性條件下復合，結果表明乳鐵蛋白-綠原酸復合物、與乳鐵蛋白-沒食子酸復合物的二級結構中α-螺旋結構含量降低，β-折疊含量增加，無規則卷曲含量增加，與本實驗結論一致。

2.5 炎癥代謝產物分析

TNF-α是細菌感染、組織破壞以及腫瘤細胞等多種刺激激活巨噬細胞而產生的一種引起炎癥反應的關鍵細胞因子[31]。TNF-α能誘導炎癥細胞因子的產生，在一定質量濃度范圍下可以保護細胞[32]，但過量的TNF-α會導致炎癥細胞因子的過度表達，從而引起一系列的炎癥反應[33]。

花青素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎的功效[34]，先前研究表明蛋白與多酚的相互作用，會在一定程度影響多酚的生物活性[35]?；ㄇ嗨匾约癝PI-花青素復合物的劑量通過MTT實驗進行檢測，劑量范圍為50～200 μg/mL，在該質量濃度范圍下并未對細胞活力產生明顯影響。

圖5 200 μg/mL劑量下花青素及SPI-花青素復合物處理細胞后TNF-α的分泌量Fig. 5 TNF-α secretion after treatment with anthocyanins or SPI-anthocyanins complex at 200 μg/mL

圖6 200 μg/mL劑量下不同質量濃度花青素與SPI復合物處理后NO的分泌量Fig. 6 NO production after treatment with different concentrations of SPI-anthocyanins complex at 200 μg/mL

本實驗以質量濃度為10 ng/mL的LPS誘導Raw264.7細胞系，結果顯示LPS誘導細胞24 h后，TNF-α含量明顯增加，加入劑量為50、100 μg/mL的花青素及SPI-花青素復合物后，TNF-α含量幾乎無明顯變化（P＞0.05）。在200 μg/mL劑量下（圖5），TNF-α的分泌量隨花青素質量濃度的升高而降低（P＜0.05）。在200 μg/mL劑量下（圖6），通過Griess試劑發現氮氧化物代謝量降低（P＜0.05），與不同質量濃度花青素對TNF-α以及氮氧化物含量影響趨勢一致，但質量濃度低于0.250 mg/mL時效果并不十分顯著。此外，發現SPI并未對炎癥產物TNF-α以及NO分泌量產生任何影響，花青素單獨存在時較SPI-花青素復合物炎癥產物分泌量少，可能是由于蛋白質與花青素結合后會形成一定的空間位阻，間接降低了花青素的抗炎能力。綜上，低質量濃度花青素與SPI復合后抗炎效果并不顯著，SPI-花青素復合物具有一定抗炎能力。

3 結 論

本實驗探究了在堿性條件下不同質量濃度花青素與SPI復合，探究花青素質量濃度對復合物結構以及抗炎能力的影響，主要結論如下：1）隨著花青素質量濃度的增加，SPI溶解度逐漸降低。2）SDS-PAGE表明，花青素會導致7S與11S中部分亞基的消耗，以及超大分子質量亞基的形成。3）熒光色譜法分析表明，花青素能夠通過改變酪氨酸與色氨酸所處的極性微環境導致蛋白發生熒光猝滅，通過Stern-Volmer方程計算得出該猝滅方式為靜態猝滅。4）圓二色光譜法分析表明，花青素會導致SPI的α-螺旋結構含量降低，β-折疊與無規則卷曲結構含量增加。5）通過酶聯免疫法以及NO試劑盒對Raw264.7細胞炎癥代謝產物的分析表明，當劑量為200 μg/mL時隨著體系花青素質量濃度的增加，炎癥代謝物TNF-α與NO分泌量呈下降趨勢。