加熱條件下α-生育酚在油脂中的抗氧化活性、損耗及其對油脂全氧化值的影響

郭曉峰，畢艷蘭，陳佳麗

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

生育酚作為一類天然抗氧化劑，其廣泛存在于植物油中。根據其苯環上甲基的位置和數目不同，可分為α-，β-，γ-和δ-生育酚[1]。生育酚抗氧化活性強，而且無毒性，還有許多對人體有益的生理功能，例如降低膽固醇、預防心腦血管疾病，增強人體免疫力和預防不育癥等[2-3]。其中α-生育酚幾乎存在于所有植物油中，其生理活性在生育酚4 種同系物中最強，是β-和γ-生育酚的2 倍，δ-生育酚的100 倍[4-5]，因而被人們廣泛研究。

Cao Jun等[6]研究認為，當油脂中的α-生育酚濃度在一定范圍內時，其抗氧化活性隨濃度增大而增強，但當其濃度高于該范圍時，其抗氧化活性會逐漸減弱。Satue等[7]研究發現當α-生育酚在精煉棕櫚油中含量高于250 mg/kg時，具有促氧化效應。吳侯等[8]在電導法實驗（110 ℃）中也發現，當生育酚濃縮物在豬油中的含量低于0.08%時，其抗氧化活性隨添加量增加而逐漸增強；當其含量超過0.08%時，隨生育酚濃縮物添加量的增大，其抗氧化活性逐漸趨于穩定。由此可知，α-生育酚在油脂中的抗氧化活性與其濃度具有一定的相關性[9]。一些學者[10-12]研究認為，由于氧化和降解，α-生育酚在加熱油脂體系中會發生損耗而降低其在油脂中的濃度。Juárez等[13]通過180 ℃煎炸實驗發現，經過14 h煎炸后，油脂中生育酚損耗高達76%。Andrikopoulos等[14]用橄欖油、葵花油和植物酥油（由葵花油、棉籽油和棕櫚油調和而成）進行煎炸實驗發現：在經過8次煎炸后橄欖油、葵花油和植物酥油中α-生育酚的保留率分別約為15%、30%和25%，煎炸后橄欖油、葵花油和植物酥油的酸度（以油酸計）由初始值0.49%、0.14%和0.14%分別變為0.46%、0.16%和0.29%；其過氧化值由1.05、1.65 mmol/kg和1.25 mmol/kg分別升至5.6、6.7 mmol/kg和5.4 mmol/kg，這說明不同油脂中α-生育酚的損耗及其對油脂品質的影響是不同的。Rancimat法以及烘箱加速氧化法是評價油脂氧化穩定性時較為常用的兩種方法。Rancimat法實驗結果可以直觀地反映油脂氧化穩定性，氧化誘導期越長，則油脂氧化穩定性越強，烘箱法可以實時監控加熱過程中油脂的氧化程度，相關研究已見諸報道[15-17]。因此，本實驗以大豆油、棕櫚油、茶油和豬油為實驗原料，分別采用烘箱法和Ranciamt法研究α-生育酚在加熱過程中的損耗及其對油脂品質的影響，對調控油脂和食品加工過程中α-生育酚的有效存留，科學使用α-生育酚提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬油 天津九源油脂有限公司；大豆油 河南陽光油脂集團有限公司；茶油 金健米業股份有限公司；棕櫚油 中儲糧油脂工業東莞有限公司；α-生育酚（≥96%，色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；冰乙酸（色譜純、分析純）、異辛烷（色譜純）、三氯甲烷（分析純） 天津科密歐化學試劑有限公司；正己烷、異丙醇（均為色譜純） 美國VBS試劑公司；硫代硫酸鈉、碘化鉀、可溶性淀粉（均為分析純） 天津永大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；7890B氣相色譜儀 美國Agilent Technologies公司；892型氧化酸敗儀 瑞士Mctrohm公司；WGL-125B電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；BSA224S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ-500超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料油脂理化指標測定

過氧化值的測定：參照AOCS Method Cd: 8-53[18]；茴香胺值的測定：參照GB/T 24304—2009《動植物油脂茴香胺值的測定》[19]；原料油脂水分和揮發物含量的測定：參照GB 5009.236—2016《動植物油脂水分及揮發物的測定》[20]；原料油脂脂肪酸組成及含量測定：參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》[21]。

1.3.2 氣相色譜條件

色譜柱：S G E B P X-7 0石英毛細柱（30.0 m×250 μm，0.5 μm）；柱箱溫度：200 ℃，進樣口溫度：210 ℃；載氣（N2）流量0.4 mL/min，壓力18.00 psi；進樣量：1 μL；分流比：30∶1；氫火焰離子化檢測器溫度：300 ℃，氫氣流量：30.0 mL/min，空氣流量：400 mL/min。

1.3.3 全氧化值的計算

全氧化值按公式（1）計算[22]：

式中：TV為全氧化值；PV為過氧化值/（mmol/kg）；AV為茴香胺值。

1.3.4 油脂加速氧化實驗

1.3.4.1 烘箱法

烘箱實驗油樣配制：由于原料油脂本身已含有一定含量的α-生育酚，因此在配制時，需要扣除原料油脂本身所含α-生育酚。準確稱取0.408、0.918 g（精確至0.1 mg）α-生育酚于1.5 L干潔塑料瓶中，并加入大豆油至1 020 g（精確至0.01 g），配成α-生育酚添加量分別為500、1 000 mg/kg的大豆油油樣，搖晃25 min使α-生育酚完全溶解并均勻分布于油脂中。同樣方法配制其他α-生育酚添加量為500、1 000 mg/kg的茶油、棕櫚油和豬油油樣（豬油和棕櫚油需在40 ℃水浴中加熱至油脂澄清透明后再進行油脂的配制，下同）。

加速氧化實驗：用電子天平準確稱取1 000.0 g（精確至0.01 g）配好的油樣于2 000 mL燒杯，超聲5 min，放入烘箱中180 ℃加熱，并分別于加熱4、12、24、36、48、60、72 h時取樣檢測，檢測指標包括α-生育酚含量、油脂過氧化值及茴香胺值。

1.3.4.2 Rancimat法加速氧化實驗[23]

不同α-生育酚添加量油脂的配制：準確稱取0.29 g（精確至0.1 mg）α-生育酚于100 mL樣品瓶中，再加入大豆油至100 g，劇烈搖晃25 min，超聲20 min至生育酚溶解均勻，得到α-生育酚添加量為3 000 mg/kg的大豆油。分別稱取4.00、10.00 g和20.00 g于100 mL樣品瓶中，并分別加入大豆油至60.00 g，得到α-生育酚添加量為200、500 mg/kg和1 000 mg/kg的大豆油。同樣方法配制α-生育酚添加量為200、500 mg/kg和1 000 mg/kg的茶油、棕櫚油和豬油。

實驗參數：空氣流量為20 L/h；反應池溫度為（110±1.6）、（120±1.6）、（130±1.6）℃；樣品質量為5.00 g；測量池蒸餾水量為60 mL。

氧化誘導期增加值按公式（2）計算：

式中：PA為氧化誘導期增加值/h；IPX為添加α-生育酚后油脂的氧化誘導期/h；IP0為原料油脂的氧化誘導期/h。

1.3.5 α-生育酚測定

1.3.5.1 油樣前處理

準確稱取0.5 g（精確至0.1 mg）油樣于25 mL棕色容量瓶中，用正己烷將瓶中油樣完全溶解后定容至刻度線，混合均勻，用0.45 μm有機濾膜進行過濾后，進行HPLC檢測。

1.3.5.2 HPLC檢測α-生育酚的實驗參數

色譜柱：Sun Fire Prep Silica柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：正己烷-異丙醇（98.5∶1.5，V/V）；進樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；熒光檢測器：發射波長330 nm，激發波長290 nm。

1.3.6 油樣中α-生育酚損耗率按公式（3）計算：

式中：C0為加熱前油樣中總α-生育酚含量/（mg/kg）；C1為加熱后油樣中總α-生育酚含量/（mg/kg）。

1.4 數據處理

使用線性擬合軟件Origin 8.5軟件來分析數據之間的線性關系。實驗數據均以 ±s表示，每組實驗都至少有2個平行樣，并且通過方差分析。采用SPSS 16.0 Duncan軟件進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 原料油脂指標分析

表1 原料油脂的脂肪酸組成及相對含量、酸價、過氧化值、茴香胺值、水分及揮發物含量Table 1 Fatty acid composition, acid value, peroxide value, p-anisidine value, and moisture content of oils and fats

表2 原料油脂的生育酚及生育三烯酚含量Table 2 Individual and total tocopherol contents and tocotrienol contents of oils and fatsmg/kg

由表1可知，本研究選用的4 種油脂脂肪酸組成具有明顯的差異：大豆油中不飽和脂肪酸相對含量較高，主要含有油酸（（25.39±0.06）%）和亞油酸（（51.76±0.05）%）；棕櫚油中棕櫚酸相對含量（（40.63±0.13）%）顯著高于其他油脂；4 種油脂中茶油油酸相對含量最高（（79.25±0.25）%）；豬油作為較為常用的一種動物脂肪，主要含有棕櫚酸（（28.37±0.60）%）、硬脂酸（（17.59±1.43）%）和油酸（（38.93±0.66）%）。4 種油脂的初始酸價、過氧化值和水分含量如表1所示，均符合食用油脂衛生標準[24-25]（GB 2716—2005《食用植物油衛生標準》和GB 10146—2015《食用植物油衛生標準》）中的相關規定。本研究旨在為α-生育酚在食用油脂的實際生產中的合理添加提供一定的參考依據，故并未對本研究所選用的動植物油脂中的天然抗氧化成分進行脫除。4 種油脂中初始生育酚和生育三烯酚種類及含量如表2所示，大豆油中生育酚種類豐富且含量較高（α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚分別為（101.14±0.85）、（693.66±1.26）mg/kg和（173.97±2.29）mg/kg），棕櫚油中含有α-生育酚（（134.59±2.75）mg/kg）和γ-生育酚（（217.62±5.72）mg/kg），此外，棕櫚油中還含有一定量的生育三烯酚（（198.51±3.15）mg/kg），茶油中主要含有α-生育酚（（128.63±3.33）mg/kg）和少量γ-生育酚（（17.84±0.98）mg/kg），豬油中3 種生育酚以及相應的生育三烯酚均未檢出。

2.2 Rancimat法評價α-生育酚對不同油脂的抗氧化活性

表3 不同溫度、不同α-生育酚添加量條件下油脂的氧化誘導期及其增加值Table 3 Effect of α-tocopherol on induction period of oil and fats in Rancimat test at different temperatures

圖1 不同溫度條件下α-生育酚添加量為1 000 mg/kg時棕櫚油的氧化誘導期Fig. 1 Oxidative induction period of palm oil with 1 000 mg/kg of α-tocopherol added at different temperatures

如表3所示，添加α-生育酚后，豬油、茶油、棕櫚油的氧化誘導期均有不同程度的增加，其中，豬油和茶油的氧化誘導期增加顯著（P＜0.05）。比較特殊的是，添加α-生育酚（200～1 000 mg/kg）后，大豆油氧化誘導期呈現縮短的趨勢，且添加量越大，大豆油氧化誘導期越短，說明在大豆油中，當添加量大于200 mg/kg時，α-生育酚對大豆油具有促氧化作用。這與胡傳榮等[26]所報道相似，具體為α-生育酚對豬油具有良好抗氧化效果，而對大豆色拉油具有一定的促氧化作用。Evans等[27]的研究發現α-生育酚在脫除生育酚的大豆油中的含量超過100 mg/kg時，對大豆油具有促氧化作用。由表2可知，大豆油中初始α-生育酚含量為101.14 mg/kg，添加200 mg/kg后超過了α-生育酚最大抗氧化含量，導致大豆油的氧化穩定性降低。高濃度下，α-生育酚在大豆油中的促氧化可能是由其氧化產物，如α-生育酚過氧自由基、α-生育酚羥自由基、α-生育酚氧自由基和單線態氧等導致，這些極性和非極性的組分能夠降低油脂表面張力，加速氧氣的傳播，進而促進油脂氧化[28]。在Rancimat實驗條件下，大量空氣（20 L/h）進入到油脂中，大豆油中生育酚迅速氧化，由此導致油脂中氧化的生育酚含量短時間內迅速增大，促進了大豆油不飽和雙鍵的氧化。

同一添加量下，隨著溫度升高，4 種油脂氧化誘導期均顯著減?。≒＜0.05）。例如，當α-生育酚添加量為1 000 mg/kg時，110、120 ℃和130 ℃條件下，棕櫚油的氧化誘導期分別為（22.2±0.04）、（11.2±0.02）h和（5.8±0.05）h（表3和圖1）。110 ℃條件下，α-生育酚添加量對4 種油脂的氧化誘導期的影響顯著；120 ℃和130 ℃條件下，α-生育酚添加量對大豆油、茶油和棕櫚油的氧化誘導期影響不顯著（表3）。

2.3 α-生育酚在加熱油脂體系中的損耗規律

2.3.1 加熱溫度和加熱時間對α-生育酚熱損耗規律的影響

圖2 不同加熱溫度下添加量為200 mg/kg時α-生育酚在棕櫚油中的損耗Fig. 2 Loss of α-tocopherol in palm oil with 200 mg/kg α-tocopherol added at different heating temperatures

由圖2和圖3可知，在同一溫度下，α-生育酚（200 mg/kg）在棕櫚油中的損耗率隨加熱時間延長而不斷增大（P＜0.05）。例如180 ℃條件下，加熱時間分別為4、24、48 h和72 h時，α-生育酚在棕櫚油中的損耗率分別為（11.58±0.63）%、（45.14±1.22）%、（75.85±0.61）%和（96.91±0.17）%。這與Bruscatto等[10]在研究180 ℃條件下米糠油中α-生育酚的損耗結果相似。相同時間內，溫度越高，α-生育酚損耗率越大（P＜0.05）。120、150 ℃和180 ℃加熱48 h時，α-生育酚在棕櫚油中的損耗率分別為（53.13±0.28）%、（62.33±0.94）%和（75.85±0.61）%，Choe等[29]在研究氧化過程中溫度和光照對葵花油中α-生育酚損耗的影響時也得出過相似的結論。此處的結果也解釋了2.1節中α-生育酚在油脂中的抗氧化效果隨著溫度升高而逐漸減弱的現象，即溫度越高，α-生育酚在油脂中損耗率越大，從而導致其抗氧化效果逐漸減弱。

圖3 180 ℃條件下不同加熱時間棕櫚油中α-生育酚的HPLC疊加圖Fig. 3 Superimposed HPLC chromatograms of α-tocopherol in palm oil heated at 180 ℃ for different periods of time

2.3.2 α-生育酚在不同油脂中熱損耗情況

由圖4可知，在一定的添加范圍內，α-生育酚在棕櫚油、大豆油、茶油、豬油中的損耗率隨其添加量增加而顯著降低（P＜0.05）。如在180 ℃棕櫚油中，當加熱24 h后，在添加量為500、1 000 mg/kg 的油樣中，α-生育酚的損耗率分別為（26.87±2.47）%、（14.29±2.47）%。結果表明，在相同溫度下，α-生育酚添加量越大，其在油脂中的熱損耗率越低，其在油脂中的絕對含量就越高，從而實現了對加熱條件下油脂中生育酚的有效保留。

此外，實驗研究發現α-生育酚在不同油脂中的熱損耗也存在差異，當添加量為500 mg/kg時，180 ℃加熱48 h后，α-生育酚在棕櫚油、大豆油、茶油和豬油中的損耗率分別為（48.81±0.63）%、（68.99±0.34）%、（92.28±0.23）%和（98.26±0.01）%，即α-生育酚在豬油中損耗率最大，棕櫚油中損耗率最小。α-生育酚在不同油脂中損耗率的差異可能與油脂中初始生育酚含量以及油脂脂肪酸組成等因素相關。一方面，不同油脂中初始生育酚種類及含量不同（表2），加熱過程中其他生育酚對α-生育酚也具有一定的保護作用；另一方面，對于不飽和雙鍵含量高的油脂而言，不飽和雙鍵與α-生育酚之間可能存在爭奪氧的競爭反應，在一定程度上能夠減緩α-生育酚的損耗，Rossi等[9]在研究煎炸條件下油脂中生育酚對自由基清除能力時也有相似的報道。當然，油脂中水分以及其他微量成分也可能會對α-生育酚的熱損耗產生一定的影響，這也有待于進一步的詳細研究。

圖4 180 ℃條件下α-生育酚在4 種油脂中損耗情況Fig. 4 Loss of α-tocopherol in oils and fats at 180 ℃

2.4 α-生育酚對加熱過程中油脂全氧化值的影響

圖5 180 ℃條件下α-生育酚對4 種油脂全氧化值的影響Fig. 5 Effect of α-tocopherol on total oxidation values of oils and fats at 180 ℃

油脂過氧化值主要反映油脂初期氧化產物氫過氧化物的含量，p-茴香胺值主要反映油脂次級氧化產物2-烯醛的含量。因此，為全面評價α-生育酚在加熱過程中對油脂品質的影響，本研究采用全氧化值作為評價指標。

如圖5所示，180 ℃條件下，無論是否添加抗氧化劑，棕櫚油、大豆油、茶油和豬油的全氧化值均隨加熱時間延長均顯著增大（P＜0.05）。對于豬油而言，添加的α-生育酚對豬油全氧化值的增長具有顯著抑制作用，α-生育酚添加量越大，抑制作用越強。例如加熱48 h時，對照組與添加500、1 000 mg/kg α-生育酚3 個實驗組豬油的全氧化值分別為101.94±0.21、86.33±0.30、74.50±0.02。而在茶油和大豆油中，α-生育酚添加量與其對油脂全氧化值增長的抑制作用相關性不大。值得注意的是，在200、500、1 000 mg/kg的添加量下，α-生育酚對棕櫚油全氧化值的增長均表現出促進作用，且該促進作用隨α-生育酚添加量增大而不斷增強。如180 ℃加熱48 h后，α-生育酚添加量為0（對照）、500、1 000 mg/kg的3 個實驗組中棕櫚油的全氧化值分別為46.02±0.32、65.87±0.08和67.45±0.12，這與Nogalakalucka等[30]研究α-生育酚對氫化油脂煎炸穩定性的結果相似。引起這種現象的可能原因是：研究所用的棕櫚油除了含有較高含量的α-生育酚外還含有一定量的生育三烯酚（表2），α-生育酚添加量較大時（≥200 mg/kg），加熱過程中α-生育酚及α-生育三烯酚被氧化，尤其是生育三烯酚，其側鏈含有3 個不飽和雙鍵，高溫條件下，更容易受到自由基攻擊，其氧化產物加速棕櫚油的不飽和雙鍵氧化從而促進了棕櫚油全氧化值的增長。

對大豆油和棕櫚油而言，α-生育酚在2.2節和2.3節兩種實驗條件下對它們的抗氧化活性具有一定的差異性。

對于大豆油而言，α-生育酚在180 ℃烘箱實驗中對大豆油具有抗氧化作用（圖5B），這與Rancimat實驗中α-生育酚促大豆油氧化有一定的差異。Jung等[31]報道稱氧化后的α-生育酚對脫生育酚后的大豆油具有促氧化作用，且隨添加量增大，促氧化作用增強。在Rancimat實驗條件（130 ℃）下，實驗研究發現受通入的空氣（20 L/h）影響，在實驗結束時大豆油中的α-生育酚含量已全部消耗殆盡，由此導致油脂中生育酚氧化產物含量的驟增，促進了大豆油中不飽和雙鍵的氧化，從而對大豆油表現出促氧化作用，即Rancimat實驗條件（130 ℃）下，α-生育酚促進大豆油的氧化。在180 ℃烘箱實驗中，當α-生育酚添加量為1 000 mg/kg時，隨著加熱時間延長，α-生育酚對大豆油的抗氧化作用逐漸減弱，72 h后α-生育酚對大豆油的全氧化值的抑制作用與添加量為500 mg/kg時無顯著性差異。當加熱時間繼續延長，由于油脂氧化程度不斷增大，油脂中α-生育酚氧化產物的含量不斷增大，進而也可能會出現促氧化的現象。

圖6 Rancimat實驗條件（130 ℃）下大豆油和棕櫚油全氧化值Fig. 6 Total oxidation values of soybean oil and palm oil under Rancimat condition (130 ℃)

對棕櫚油而言，在Rancimat實驗條件（130 ℃）下，添加α-生育酚棕櫚油的氧化誘導期較對照組顯著增大（表3），這與烘箱實驗中α-生育酚的促氧化作用有一定的差異。通過分析Rancimat實驗中兩組棕櫚油氧化誘導期時的全氧化值（圖6）可知，對照組與實驗組棕櫚油的全氧化值并無顯著差異（P＞0.05）；在大豆油中，兩個實驗組油樣全氧化值之間也并無顯著差異（P＞0.05）。對比這兩種情況可知，在不同的實驗條件下，用以評價α-生育酚對油脂的抗氧化效果存在一定的偏差，因此在評價抗氧化劑抗氧化效果時最好結合抗氧化劑的實際使用條件選擇合適研究條件更有實際意義。

3 結 論

加熱條件下，油脂中的α-生育酚發生損耗，影響其抗氧化活性。不同油脂中，α-生育酚的添加量對油脂氧化誘導期及熱穩定性具有顯著影響，尤其是在不飽和脂肪酸含量或VE（生育酚及生育三烯酚）含量較高的油脂中，如大豆油、棕櫚油中，使用α-生育酚作為外源抗氧化劑時，一定要考慮其添加濃度、使用溫度以及空氣帶入量等因素。Rancimat實驗結果表明：110 ℃條件下，α-生育酚（200～1 000 mg/kg）能有效延長豬油和茶油的氧化誘導期，對棕櫚油氧化誘導期影響不明顯，而在大豆油中，當添加量高于200 mg/kg時，α-生育酚具有促氧化作用；180 ℃條件下，添加量為500、1 000 mg/kg時，α-生育酚對大豆油、茶油和豬油全氧化值的增長具有顯著抑制作用（P＜0.05），而在棕櫚油中，當添加量高于500 mg/kg時，α-生育酚則具有促氧化作用。不同實驗條件下，用以評價α-生育酚對油脂抗氧化效果之間也存在一定的偏差，因此在評價抗氧化劑抗氧化效果時最好結合抗氧化劑的實際使用條件選擇合適的研究條件更有實際意義。