UPLC-MS/MS法測定人血漿中金剛烷胺的含量

江峰

帕金森?。≒arkinson disease，PD），是中老年常見的運動障礙疾病，目前以藥物治療最為有效[1]。中國帕金森指南將金剛烷胺作為首選治療以震顫為主及年齡〈65歲的早期PD患者[2]。結合國情，金剛烷胺作為治療PD基藥[3]納入國家醫保甲類目錄[4]。然其治療窗窄，過量致昏迷、死亡[5]，腎功能障礙者易蓄積中毒[6]，故應開展臨床用藥監測。有文獻報道采用LC-MS法，但存在局限性，如檢測時間長（≥6.5 min）、靈敏度低、樣本處理過程復雜、血漿用量較大等[7-10]。本實驗建立一種快速、靈敏、操作簡便的UPLC-MS/MS法，旨在為臨床開展治療藥物監測和藥動學探究提供方法學基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQD三重四級桿質譜儀、MassLynx數據處理系統（美國Waters公司）；Vortex-Genie 3多功能旋渦混合器（美國Scientific Industries公司）；HSC-12A恒溫槽（天津恒奧科技發展有限公司）；Herens Pico 21離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；AE-240電子天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；pHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）；Milli-Q5 超純水機（德國默克密理博公司）。

1.2 藥品和試劑

金剛烷胺（純度：97%，批號：MKBF8627V）購自美國Sigma公司；鹽酸偽麻黃堿（內標純度：100%，批號：171237-200304）由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、甲酸、乙腈為色譜純（德國默克公司），二氯甲烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；超純水（德國默克密理博公司）。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液和內標溶液的配制

精密稱取金剛烷胺對照品2.33 mg，置于100 ml量瓶，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為23.3 μg·ml-1的金剛烷胺儲備液。將金剛烷胺儲備液稀釋200倍配成116.5 ng·ml-1金剛烷胺工作液，備用；精密稱取內標鹽酸偽麻黃堿對照品1.24 mg，置于100 ml量瓶，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為12.4 μl·ml-1的鹽酸偽麻黃堿儲備液。用超純水稀釋鹽酸偽麻黃堿儲備液，配制成2.5 μg·ml-1的內標溶液。

2.2 色譜條件

采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相為0.01%甲酸水（A）—甲醇（B）。流速：0.25 ml·min-1；進樣體積：5μl；柱溫為30 ℃。采用梯度洗脫，即0 min時，A：B=（80：20，v/v），1.5min 時，A：B=（10：90，v/v）2 min 時，A：B=（10：90，v/v），4 min 時，A：B=（80：20，v/v）。

2.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI源），多反應離子監測（MRM）正離子模式；金剛烷胺離子反應為：m/z152.2→135.48；毛細管電壓3.7 kV，錐孔電壓35 V，碰撞能量16 eV；內標偽麻黃堿離子反應：m/z166.29→148.29；毛細管電壓3.7 kV，錐孔電壓20 V，碰撞能量10 eV。

2.4 血漿樣品處理

取血漿樣品500 μl置10 ml玻璃離心管中，加入20 μl內標溶液（2.5 μg·ml-1），混合后加入2 ml二氯甲烷，渦旋混勻2 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液1.5 ml，40℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣加1 ml流動相復溶，渦旋3 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，1 μl進樣。

2.5 方法學考察

2.5.1 基質效應考察 分別取5種不同來源的空白血漿500 μl，經液液萃取N吹干后，加入流動相配置的金剛烷胺和內標偽麻黃堿混合溶液（金剛烷胺濃度依次是1、150、600 ng·ml-1每個濃度各5 管），通過UPLC-MS/MS法分析，獲得峰面積，與相應濃度混合對照品溶液峰面積之比評價基質效應，結果均在88%～100%之間，結果表明，本方法金剛烷胺及其內標的測定均不受基質效應干擾。

2.5.2 標準曲線制備 取金剛烷胺工作液加入空白血漿中，配制成濃度為 0.7，2.8，7，28，70，140，280，700 ng·ml-1的含藥標準血漿樣品，按”2.4”處理后，再按“2.2”“2.3”條件進樣測定，記錄色譜圖；以金剛烷胺濃度（x）為自變量，峰面積和內標峰面積比（y）為應變量，用加權（W=1/χ2）最小二乘法進行線性回歸分析，得回歸方程：y=0.01261x+0.01737（r=0.997 3），結果表明，金剛烷胺在0.7～700 ng·ml-1范圍內（r=0.997 3）有良好線性關系，定量下限為0.7 ng·ml-1。

2.5.3 專屬性試驗 空白血漿、含藥血漿樣品（含內標）和患者血漿樣品（含內標）分別按“2.2”“2.3”“2.4”方法考察血漿中內源性物質及常規合并用藥是否干擾測定。所得色譜圖見圖1。金剛烷胺與內標的出峰時間分別為2.14 min、1.00 min；二者能很好地分離，峰形良好，無雜質峰干擾。結果表明，空白血漿中內源性物質不干擾金剛烷胺及內標的測定。

圖1 金剛烷胺色譜圖

表1 回收率和精密度試驗結果 （n=5）

表2 金剛烷胺穩定性試驗結果（n=5）

2.5.4 回收率和精密度實驗 取空白血漿，配制金剛烷胺濃度分別為1、150、600 ng·ml-1的對照品血漿各5份，按“2.4”操作并進行UPLC-MS分析，將結果與相應濃度對照品水溶液結果比較，求算提取回收率及隨行的標準曲線計算方法回收率。同時，每種濃度樣品在一日內平行操作測定5次，考察日內精密度。同法每日操作測定1 次，連續5日，考察日間精密度。數據見表1。

2.5.5 穩定性實驗 取空白血漿配制成1、150、600 ng·ml-1的含藥標準血漿樣品各5份，考察樣品在不同保存條件下的穩定性。結果表明金剛烷胺經過-20 ℃放置30 d，3次反復凍融，以及室溫放置3 d均穩定。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

考察了水、0.01%甲酸和0.1%甲酸，發現流動相中加入甲酸可明顯增強待測物響應，且0.01%甲酸效果優于0.1%甲酸；恒速洗脫易使金剛烷胺峰形變寬，梯度洗脫可使峰形良好。

3.2 內標的選擇

通過考察偽麻黃堿對血漿中金剛烷胺測定的影響，結果表明用偽麻黃堿作內標其保留時間為1.0 min，而金剛烷胺保留時間為2.14 min，二者分離度達5.5，不會被其它雜質干擾。

3.3 生物樣品處理方法的選擇

比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、乙醚-二氯甲烷（4：1）（v/v）[11]、環己烷、正戊烷對金剛烷胺的萃取效果，以二氯甲烷效果最好，可顯著減少雜質干擾，且萃取回收率最高，故選其為萃取劑。血漿樣品處理參考了文獻[11-12]萃取劑、渦旋時間以及流動相等并做改進，分離效果良好。

3.4 標曲范圍的選擇

本研究是為建立測定人血漿金剛烷胺血藥濃度方法學，通過前期預實驗，得金剛烷胺谷濃度范圍（529.73±86.49）ng·ml-1。故選取的標準曲線范圍足以用于臨床對金剛烷胺的監測。

3.5 實驗方法的選擇

金剛烷胺臨床給藥劑量較低，濃度測定靈敏度要求較高，故本實驗采用UPLC-MS/MS法，在3 min內完成金剛烷胺的定量分析，提高工作效率。采用MRM模式，屏蔽其他成分的影響，并用內標法定量，極大地提高準確性。

4 小結

本文建立了測定人血漿金剛烷胺血藥濃度UPLC-MS/MS 法，該法快速、靈敏、準確、操作簡便，可用于血藥濃度監測以及藥動學相關性研究。