不同比例配伍澤瀉湯對高脂血癥大鼠血脂代謝及炎癥因子影響

林高城 陳云歡 楊莉惠 陳雨 鄒愉龍 余友金

動脈粥樣硬化（As） 是一種由血脂代謝紊亂和血管慢性炎癥共同作用而形成的疾病，單核/巨噬細胞系統在AS形成中扮演著重要的角色[1]。在高脂血癥狀態下，為了清除局部組織和血液系統中過多的脂質，全身單核/巨噬細胞被激活，大量增生并攝取氧化型低密度脂蛋白從而轉化為泡沫細胞，分泌大量的炎癥因子如IL-1β、TNF-α、IL-6，加重局部炎癥反應。澤瀉湯具有降脂、利水、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[2]。本文在張仲景《金匱要略》記載的澤瀉、白術5：2配伍比例的基礎上設計了 1：1、2：5組，來對比研究澤瀉湯的降血脂以及抑制炎癥因子表達的作用，探討配伍比例對澤瀉湯降血脂及抗炎癥因子作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

TNF-α、IL-6購自于武漢博士德生物科技有限公司，脂多糖為Sigma公司，臺盼藍染色液購于solarbio公司，PBS緩沖液、1640培養基購自Hyclone有限公司，SD大鼠（雄性）40只，購自福建醫科大學實驗動物中心（許可證號：SCXK（閩）2012-0001），Leica DM IL LED 倒置顯微鏡，細胞培養箱（ Therom 公司，美國） 等。

1.2 實驗動物及分組

SD大鼠40只，體質量160～260 g，購自福建醫科大學實驗動物中心,根據隨機數字表將大鼠隨機分為正常對照組、高脂血癥組、A組、B組，C組，每組8只，飼養于SPF動物實驗室，室溫25℃、濕度 45%～65% ，喂食標準飼料。實驗時間為2015～2017年。

1.3 澤瀉湯的制備

澤瀉、白術均購自于福建中醫藥大學附屬康復醫院，參考中藥藥理實驗方法學（上?？茖W技術出版社，李儀奎著）制備相當于生藥材2.64 g/ml的藥液：第一煎加水量約為總藥量的6倍，浸泡1 h，煎煮大概 20 min；第二煎加水量約為總藥量的4倍，煎0.5 h，兩次藥液混合后，再濃煎壓縮，4℃冰箱儲存備用。

1.4 動物造模

正常對照組SD大鼠用普通大鼠飼料常規喂養，高脂血癥組、A組、B組、C組均用大鼠高脂飼料（即豬油10%，丙基硫氧嘧啶0.2%，膽固醇1%，脫氧膽酸鈉0.5%，蛋黃粉5%，蔗糖5%，基礎飼料78.3%，配方參照王瓊等[3]的研究）喂養，A、B、C組在給予高脂飲食喂養的同時給予相對應的澤瀉湯灌胃，按1 ml/100 g灌胃給藥，A組：澤瀉：白術＝5：2， B組：澤瀉：白術＝1：1，C組，澤瀉：白術＝2：5；每天2次，連續20 d，正常對照組及高脂血癥組給予等量生理鹽水灌胃。

1.5 血脂檢測

5組大鼠在干預第20日后，均禁食不禁水12 h，經大鼠眼眶取血，根據各指標試劑盒說明書，檢測血漿中TC、TG、LDL-C含量。

1.6 大鼠腹腔巨噬細胞提取及細胞培養

借鑒蘭青等[4]辦法提取大鼠腹腔巨噬細胞，詳細方法如下：頸椎脫臼處死大鼠，手抓大鼠尾部將其浸入70%乙醇中，浸泡5～8 min后，從大鼠腹腔一側近45°角刺入腹腔，注射 1 640培養液 35～50 ml，在工作臺上打開大鼠腹腔，吸取其腹腔液約10 ml，1 200 r/min 離心8 min。去掉上清液后，留下離心管底部乳白色沉淀物，臺盼藍染色顯示細胞存活率＞95%。

1.7 脂多糖干預及炎癥因子測定

各組大鼠腹腔巨噬細胞培養24 h后，吸去上清液，加入脂多糖（ 10 mg /L）繼續培養24 h，之后進行TNF-α及IL-6的檢測。EILSA法檢測IL-6和 TNF-α濃度。操作步驟按說明書進行。均在450 nm波長讀取OD值，繪制出標準曲線自動計算IL-6和TNF-α濃度。

1.8 統計學方法

所有數據采用SPSS 17. 0 統計軟件進行處理，實驗數據以（）表示，組間差異比較用F檢驗及獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同配伍澤瀉湯對高脂血癥大鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，高脂血癥組大鼠血清TC、TG、LDL-C明顯上升（P＜0.05），說明建立模型成功；A組、B組、C組的TC、LDL-C 的水平均顯著低于高脂血癥組（P＜0.05）,但高脂血癥組與澤瀉湯不同比例配伍組的TG比較變化不顯著（P＞0.05），說明不同配伍比例的澤瀉湯組都具有明顯的降低TC、LDL-C作用。A組、B組的TC、LDL-C的水平均明顯小于C組（P＜0.05），且A組降脂幅度更優于B組（P＜0.05），說明澤瀉：白術＝5：2在降血脂方面有明顯優勢。見表1。

2.2 各組大鼠巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6 表達的影響

與正常對照組比較，高脂血癥組TNF-α、IL-6 表達均增加顯著（P＜0. 05）；與高脂血癥組比較，A組、B組、C組TNF-α、IL-6 表達均明顯下降（P＜0. 05）；A組、B組TNF-α、IL-6 表達均明顯小于C組（P＜0. 05）；且以A組下降更為顯著（P＜0.05）。見表2。

3 討論

現代藥理學研究表明澤瀉含有重要降血脂作用的成分為三萜類化合物，這種化合物主要有澤瀉醇 A、澤瀉醇 B、24-乙酰澤瀉醇A等。研究發現澤瀉醇 B 能影響血管平滑肌細胞，發揮澤瀉治療動脈粥樣硬化的作用[5]，24-乙酰澤瀉醇A 不僅能抑制巨噬細胞、平滑肌細胞炎癥反應而且還能抑制平滑肌細胞遷移、表型轉化，改善泡沫細胞脂質累積等作用[6-7]。炒白術有比較顯著抗脂質沉積及抗氧化作用，能增強人的免疫功能。從本實驗結果觀察，不同配伍比例的澤瀉湯均能顯著降低高脂血癥大鼠血清中的 TC、LDL-C 水平，其中澤瀉、白術按經典比例配伍即 5：2 降血脂效果最明顯，配伍比例1：1 的降血脂作用次之，由此可見，配伍比例對澤瀉湯降血脂作用有一定影響。

表1 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血脂水平比較（mmol/L，±s）

注：與正常對照組比較，；與高脂血癥組比較；與澤瀉湯 A 組比較

表2 各組大鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α及IL-6 表達比較（ng/L，）

表2 各組大鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α及IL-6 表達比較（ng/L，）

注：與正常對照組比較，；與高脂血癥組比較；與澤瀉湯 A組比較

已有研究表明高脂血癥可促進巨噬細胞形成泡沫細胞[8]，經過LPS刺激后巨噬細胞可分泌大量的炎癥因子[9]如TNF-α、IL-1β、IL-6加重局部病灶的炎癥反應。腫瘤壞死因子α通過促進血栓形成，誘導血管內皮細胞壞死、新生微小血管形成從而促進AS發生，在AS形成病理學方面，不管是在動脈發生內膜增生還是內皮功能紊亂的過程中，TNF-α都扮演著重要作用[10-12]。TNF-α和IL-6通過抑制ATP結合盒轉運子抑制巨噬細胞內膽固醇排出[13]，白介素6可上調巨噬細胞低密度脂蛋白受體表達，促進巨噬細胞吞噬更多的低密度脂蛋白，加速脂質沉積在血管壁上從而形成動脈斑塊,白介素6還可通過刺激巨噬細胞分泌單核細胞趨化蛋白（MCP-1），MCP-1可促使單核-巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞聚集于血管內皮引起炎癥反應[14]。

本實驗通過較長時間的高脂飲食喂養，成功建立高脂血癥模型，研究發現，高脂血癥組巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-6的表達較正常對照組顯著增加，提示高脂血癥大鼠處于慢性炎性反應狀態，TNF-α和IL-6協同參與了動脈粥樣的形成，經澤瀉湯治療后的大鼠腹腔巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-6明顯減少，尤其是經典澤瀉湯配伍A組下降最明顯。澤瀉湯可通過影響炎癥因子與血脂代謝改善大鼠機體慢性炎癥狀態，然而這一過程涉及的機制十分復雜，尚需更深入的研究與探索。